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DB22DB22/T2015—2014坏死梭杆菌检测PCR法DeterminationofFusobacteriumnecrophorum—PolymeraseChainReaction吉林省质量技术监督局发布I请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些1警告——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问GB/T6682分析实验室用水规格和WS/T230临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用坏死梭杆菌fusobacteriumnecro体外酶促合成特异性DNA片段的一种分子生物学实验方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸分别与两条模板DNA链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核苷三磷酸DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleosideadNTP:脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosbate）。2针对坏死梭杆菌白细胞毒素两亚种启动子的特异性区域基因序列设计引物，应用聚合酶链反应除非另有说明，所有的化学试剂均为分析纯。实验用水规格应符上游引物：P1:5-GCTCTCCTGCTTGTTT上游引物：P2:5-GATCTTTGTTGGAAGC下游引物：P3:5-GCACGACAA）（）：），37.8微量可调移液器：0.2μL～2μL，2用无菌棉拭子沾取疑似感染坏死梭杆菌的动物病灶的病健结合处的组织或脓汁，放入灭菌的冻存吸取上清至另一灭菌EP管，12000r/min离心5min，弃上清；加200µLTE重悬沉淀，12000r/min离心5min，弃上清，洗三次；沉淀加200µLT基因组DNA；按照基因组试剂盒说明书分别提取坏死梭杆菌necrophorum亚种（ATCC27852）和坏死梭杆菌funduliforme亚种（ATCC51357）基因组42.02.5Mg2//（25mM）2.0注：按照上述试剂顺序逐项加样至已编好号的0.2mL的P用TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板（溴化乙锭终浓度0.5μg/mL加入1×TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增产物6μL与6μL上样缓冲液混合，分别加入样品孔中，取5μLDNAMarkerDL2000加入到标准分子量对照孔内。5V/cm恒压电泳30min-455用凝胶成像系统进行分析。在阴性和阳性对即判定为Fnn亚型；出现809bp特异性片段，即为Fnf亚型。必要时取PCR扩增产物进行测序，如果结果6

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