DB15T+3534-2024籽用西葫芦叶片三种病毒RT-PCR检测技术规程

ICS65.020.01CCSICS65.020.01CCSB04内蒙古自治区地方标准DB15/T3534—2024RT-PCR技术规程TechnicalcodeofpracticeforRT-PCRdetectionofthreevirusesTechnicalcodeofpracticeforRT-PCRdetectionofthreevirusesfromleavesofseed-usedpumpkin(CucurbitapepoL.)2024-06-282024-07-28内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/T3534—2024前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（SAM/TC25）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古弘昌农业有限责任公司、呼和浩市农牧技术推广中心。本文件主要起草人：王萍、龙建国、刘杰才、陈贵华、苏利民、孙婧、许珂、尚鹏。IIDB15/T3534—2024DB15/T3534—2024DB15/T3534—2024DB15/T3534—2024籽用西葫芦叶片三种病毒RT-PCR检测技术规程范围RT-PCR（Cucumbermosaicvirus，CMV）（Watermelonmosaic（Zucchiniyellowmosaic的RT-PCR本文件没有规范性引用文件。下列术语和定义适用于本文件。黄瓜花叶病毒Cucumbermosaicvirus黄瓜花叶病毒Cucumbermosaicvirus（Cucumovirus）1000西瓜花叶病毒WatermelonmosaicvirusYY小西葫芦黄化花叶病毒ZucchiniyellowmosaicvirusYY4试剂与材料1试剂PremixTaqTRIzolPCRTransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMixpMD18-TDH5a、DNA100bp～500bp的DNA溶液配制10mol/L(NaOH160mL80.0g200mL。0.5mol/L(EDTA-Na2)pH8.018.6g70mL4.3EDTA-Na24.3)pH至8.0加水定容至100mL。在121℃条件下灭菌20min。1mol/LTris-HCL(pH8.0)121.1g800mLpH8.01000mL12120min。TEpH8.0)10mL4.52mL4.41000mL12120min。50×TAE242.2gTris500mL100mL4.4pH8.01000mL1×TAE。250.0mg10mL12h250.0mg10mL50.0g30mL3100mL4CMVCMV-F:5’-TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3’CMV-R:5’-AGACGTGGGAATGCGTTGGTGCT-3’345bpAA.1)。WMV病毒检测上游引物WMV-F:5-CCAGTGGCAAAGGTGATA-3WMV-R:5435bpAA.2)。ZYMV病毒检测上游引物ZYMV-F:5’-ATGCAGAGGCACCATACAT-3’，下游引物ZYMV-R:5’-TACTGCATTGTGTTCACACC-3283bpAA.2)。TE4.6）10μmol/L。分析天平、组织研磨仪、PCR扩增仪、电泳槽、电泳仪等电泳装置、Nanodrop微量分光光度计、凝胶成像系统或照相系统、切胶仪、离心机。以通过RT-PCR扩增和测序分析明确含有CMV、WMV、ZYMV的样品为阳性对照。通过RT-PCR扩增明确不含有CMV、WMV、ZYMV的样品为阴性对照。2以灭菌ddH2O作为模板进行PCR扩增的产物为空白对照。-80重复次数每个对照和试样设置2次重复。RNA提取和质量检测RNA0.12mL1mLTRIzol试剂后混匀，提取总RNA。RNARNANanodropRNAOD260/OD2801.8～2.0RT-PCR电泳结束后，观察结果（参见附录B.1）。如果总RNA条带清楚，就可以用于后续实验。反转录1μgRNAμLAnchoredRNase-Free65电泳结束后，观察结果（参见附录B.1）。如果总RNA条带清楚，就可以用于后续实验。反转录1μgRNAμLAnchoredRNase-Free6552min10μL2×TSμL1μLgDNARemover，4230min。855sec-20PCR扩增8.4.1在PCR管中按表1依次加入反应试剂，混匀。表1PCRPCR2secPCRPCRPCR3min30sec305850ZYMV50℃），72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCRPCR琼脂糖凝胶电泳检测3试剂体积PremixTaq25μLcDNA2μL10μmol/L上游引物1μL10μmol/L下游引物1μLddH2O补足50μL1g100mL1×TAE8μL1×TAE5μLPCR10μLDNAPCR4℃连接至pMD18-TNCBICMVWMVZYMVAPCRDNADNAB.2CMV345bp、WMV485bp、ZYMV283bp44附录A（资料性）籽用西葫芦叶片CMV/WMV/ZYMV特异性片段序列CMVWMVZYMV注1：序列方向为5’-3’。注2：5’下划线为PCR上游引物序列，3’下划线为PCR下游引物的反向互补序列。5附录B（资料性）籽用西葫芦叶片CMV/WMV/ZYMV的RT-PCR检测电泳图RNAB.1。图B.1籽