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备案号：33827-2012DB46DB46/T220—2012槟榔苗黄化病植原体PCR检测技术规范TechnicalspecificationforPCRdetectionofarecanutyellowleafphytoplasmaofseedling海南省质量技术监督局发布I1GB/T6682-2008分析实验室用台式高速冷冻离心机（最高转速在12000rpm以上）、全自动数码凝胶图像分析系统、PCR仪、2称取抽样的槟榔植株刚抽出的心叶0.5g，加入适量液氮研磨呈粉状，再加入1mLDNA提取缓冲液min；加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）混匀，4℃6000rpm离心5mi上清液，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（2），引物序列5’-3’PCR反应条件为：94℃,预变性2min；94℃变性1min；45℃退火45s，72℃延伸1min；共进行30加样量(μL）3加样量(μL）取5µLPCR产物在1％琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴化量标准，在120V电场强度下电泳约20min，最后用全自动数将第二轮PCR产物进行序列测定，序列结果利用植原体分类鉴定的在线专用数据库-iPhyClassifier（http://plantpathology.b否否是是是否否是是否体否否是否-否否否--否是---是----4引物/探针序列5’-3’TaqManUniversalRCRMast否否是是是否否是是否否否是否 否否否--否是 是----5TaqDNA聚合酶、10×PCR缓冲液、dNTP液（2.5mmol/LdATA.3缓冲液称取186.1gNa2•EDTA•2H2O，置于1L烧杯中，加入约800mlNaCl，充分搅拌，用去离子水将溶液定容至100A.3.6TAE电泳缓冲液（50×)（pH约86

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