SNT 1961.10-2013 出口食品过敏原成分检测 第10部分：实时荧光PCR方法检测虾蟹成分

出口食品过敏原成分检测第10部分：实时荧光PCR方法检测虾/蟹成分I 第3部分：酶联免疫吸附法检测荞麦蛋白成分：——第4部分：实时荧光PCR方法检测腰果成分；——第6部分：实时荧光PCR方法检测胡桃成分； 第11部分：实时荧光PCR方法检测麸质成分 本部分为SN/T1961的第10部分。民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、上海辉睿生物科技有限出口食品过敏原成分检测第10部分：实时荧光PCR方法检测虾/蟹成分25.1.1.1虾16SrRNA基因的第一对检测引物和探针序列5.1.1.2虾16SrRNA基因的5.1.1.3北极虾16SrRNA基因的检测引物和探针序列1%CTAB,0.05mol/LTris-HCl(pH8.0),0.7mol/LNaCl,0.01mol/LED35.3TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA缓冲液)10mmol/LTri5.770%乙醇。5.8TaqDNA聚合酶。200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/LKCl,15mmol/LMgCl₂。6仪器和设备6.1实时荧光PCR仪。6.2离心机：离心力≥12000g。6.4冰箱：2℃~8℃,-20℃。6.5高压灭菌器。6.6研钵及粉碎装置。6.7核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.9恒温水浴箱。7检验步骤7.1制样方法称取约200g样品，用研钵或粉碎装置将样品粉碎至粉末状。7.2样品的总DNA提取7.2.1称取2.0g已制备好的样品于50mL离心管中，加入10mL裂解液，65℃温育1h,每隔10min振7.2.27000g离心5min,吸取上清液至一新离心管中，加入400μL三氯甲烷和异戊醇的混合液，体积比为24:1,充分混匀；7.2.312000g离心5min,吸取上清液至一新离心管中，加0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1h~2h;7.2.412000g离心10min,弃上清液；7.2.570%乙醇洗涤一次，12000g离心5min,弃上清液，晾干；7.2.6加入50μLTE,溶解DNA沉淀。也可用等效的商品化核酸提取试剂盒提取模板DNA。7.3DNA浓度和纯度的测定取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm4c=A₂60XN×50 A₂60——260nm处的吸光值；当浓度为10μg/mL～100μg/mL,A₂bo/A280比值在1.7～1.9之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。7.4实时荧光PCR检测7.4.1实时荧光PCR反应体系过敏原虾/蟹成分荧光PCR反应体系见表1。表1过敏原虾/蟹成分荧光PCR反应体系下游引物DNA模板注：各组分的用量可根据反应体积进行适当的调7.4.2实时荧光PCR反应参数预变性95℃/30s,1个循环；95℃/15s,60℃/4gs,45个循环，在每次循环的退火时收集荧光信号。反应参数可根据基因扩增仪型号以及所使用试剂的不同而进行适当的调整。每个样品设置两个平行反应体系。检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含虾/蟹成分的样品作阳性对照，用已知不含虾/蟹成分的样品作阴性对照，用等体积的ddH₂O代替模板DNA作空白对照。8结果判断及表述8.1结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值不出现任何数值为准。5