植物生理学实验报告叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定

实验报告课程名称： 植物生理学及实验 实验类型：探索、综合或验证实验项目名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定实验目的和要求掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下：叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂.常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。取代反应。在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。

H+取代Mg2+,Cu2+(Zn2+)取代H+。叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。透射光下呈绿色，反射光下呈红色。光谱分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。三、主要仪器设备天平（万分之一）、可扫描分光光度计（UV-1240）、离心机研具、各种容（量）器、酒精灯等四、操作方法与实验步骤定性分析称取鲜叶3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成匀浆取匀浆过滤，并倒入三角瓶中，同时观察荧光现象。取三角瓶中约1ml溶液于小试管。加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和H2O1ml分层后观察。取代反应：加醋酸约1ml，取1/2加醋酸铜粉加热。观察颜色变化。叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：取皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nmOD0.5-1）取下层绿色溶液（留1/3），反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)→稀释（663nmOD0.5-1）两者在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰叶绿素定量分析：鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取2份0.2ml加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb和Chl总量的值。五、实验数据记录和处理1、定性分析：观察荧光现象，透射光为绿色，反射光为红褐色光。皂化反应(3ml)：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。图表SEQ图表\*ARABIC1图表SEQ图表\*ARABIC2图表SEQ图表\*ARABIC3图表SEQ图表\*ARABIC1图表SEQ图表\*ARABIC2图表SEQ图表\*ARABIC3图表SEQ图表\*ARABIC4图一在411nm以及432nm波长处吸收光谱出现峰值，都位于蓝紫光的波长范围内，根据类胡萝卜素吸收蓝紫光的特性，可以推测图二是类胡萝卜素的吸收光谱。图二在424nm左右及644nm左右波长处吸收光谱出现峰值，两者分别位于蓝紫光和红光的波长范围内，根据叶绿素吸收蓝紫光和红光的特性，可以推测图一是叶绿素的吸收光谱。3、叶绿素定量分析：将数值代入式子，计算得：波长/nm645652663OD第一组0.0870.1160.205第二组0.0810.1150.206第三组0.0880.1210.207平均0.0850.1170.206Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69OD645=12.7*0.206-2.69*0.087=2.38mg/LCb(mg/L)=22.9OD645-4.68OD663=22.9*0.085-4.68*0.206=0.982mg/LCT(mg/L)=Ca+Cb=3.36mg/LChla含量(mg/g.FW)=（Ca(mg/L)/1000）*2/0.1*5/0.2=1.19mg/g.FWChlb含量(mg/g.FW)=（Cb(mg/L)/1000）*2/0.1*5/0.2=0.491mg/g.FWChl总含量(mg/g.FW)=（CT(mg/L)/1000）*2/0.1*5/0.2=1.68mg/g.FW六、实验结果与分析1、定性实验中，各组实验观测是颜色变化基本相同，区别只是颜色的深浅，与研磨时加入的叶片量、研磨的程度等因素有关。2、从定量实验所得数据的计算结果来看，实验所用的叶片，叶绿素a的含量大约是叶绿素b的三倍左右。根据观察比较其他小组的数据，“三倍”大致相同。3、邻组所得实验数据与我们的数据有一定差距，分析可能是因为研磨的充分程度不同和所取叶片位置不同，导致叶绿素含量有所区别。七、讨论、心得1、为什么叶绿素吸收红光和兰紫光？叶绿素有基态（G），第一单线激发态（E1）和第二单线激发态（E2）及第三线态（E3），光子吸收必须遵守普朗克定律。被吸收光子能量必须等于激发态和基态的能量差。蓝紫光能量大，可使叶绿素分子中的电子跃迁到E2，而红光能量小，只能使其跃迁到E1，故叶绿素只能吸收蓝紫光和红光。2、为什么可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱？因为由于叶绿素皂化反应后的叶绿素盐并不影响叶绿素分子的骨架结构，叶绿素对光的吸收规律与叶绿素盐对光的吸收规律几乎是相同的，而且皂化反应可以从叶绿体色素中只筛选出叶绿素，排除了其他色素的干扰，所以可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱。3、如要区分叶绿素a和b的吸收光谱，可用什么方法。 原理：叶绿素a在645nm和663nm处均有吸收，在645nm处吸光系数较小，，在663nm处较大；叶绿素b在645nm和663nm处亦都有吸收，但在645nm处吸光系数较大，在663nm