辣椒炭疽病抗性室内鉴定技术规程

2辣椒炭疽病抗性室内鉴定技术规程本文件规定了辣椒炭疽病室内鉴定所需接种体制备方法、抗性鉴定方法、病情调查方法、抗性鉴定评价方法以及记载表格技术内容。本文件适用于辣椒品种（系）在室内条件下对炭疽病抗性水平的鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T2060.1辣椒抗性鉴定技术规程第1部分：辣椒抗疫病鉴定技术规程3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4材料准备4.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基制备（PDA，PotatoDextroseAgar）马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g，加水定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌25min，冷却备4.2病原菌准备4.2.1病原菌分离采用常规组织分离法，从辣椒果实病斑处分离纯化后获得病原菌。4.2.2病原菌鉴定采用形态学鉴定和分子鉴定方法确定病原菌种类，分子鉴定方法详见附录A。4.2.3病原菌活化病原菌于PDA培养基活化后，再转接至新的PDA培养基中，暗培养7天后备用。34.3对照品种选择感病对照品种：‘茄门甜椒’。抗病对照品种：‘PBC932’，亚蔬-世界蔬菜中心。4.4鉴定材料准备鉴定材料播种、育苗、定植、水肥管理、采摘按常规田间管理进行，采摘前2周不喷施杀菌剂。采摘果实形状、大小一致的绿熟果，清水洗净后晾干，放入75%乙醇溶液中浸泡5min，无菌水冲洗干净，置于超净工作台中晾干，备用。5室内抗性鉴定5.1接种方法无菌接种针刺伤离体绿熟果表皮，根据果实大小，每个果实3~4个伤口，伤口深1mm~2mm，直径1.5mm~2mm，使用3mm琼扩打孔器，沿活化后的菌落边缘打取接种菌块。菌块菌丝面贴附于带辣椒果实表面伤口处，并进行菌饼固定。5.2接种后管理接种后辣椒果实置于保鲜盒中，用保鲜膜密封后至于温度为28℃、湿度为90%以上条件下暗培养，培养3d后将湿度降为40%~50%，于接种后第7d统计发病情况。5.3病情调查根据辣椒炭疽病发病程度分级标准（表1），记录接种辣椒果实炭疽病发病情况，计算病情指数。病情指数（DI）=∑(各级病斑数×该病级代表数值)／(调查病斑总数×调查最高级值)×100表1辣椒炭疽病发病程度分级标准10213243545.4抗病性评价当感病对照的病情指数（DI）＞30，抗炭疽病鉴定即为有效。依据病情指数对不同辣椒品种抗性级别进行划分，划分标准见表2。表2辣椒炭疽病抗性分级标准06记载表格参照NY/T2060.1的记录方法，将统计鉴定结果记载在附录B中。5附录A辣椒炭疽病分离物分子鉴定方法采用CTAB法提取各菌株DNA，PCR扩增各个菌株的ITS、TUB、GAPDH、ACT、CAL和CHS共6个基因序列，测序后将获得的序列分别在NCBI上进行BLAST比对分析，确定基因序列与已知炭疽菌种相似；将相似炭疽菌种作为参照菌株，从GenBank数据库中下载其对应基因序列用于聚类分析，将所有比对菌株基因序列按照ITS-TUB-GAPDH-ACT-CAL-CHS的顺序首尾相连拼接；利用MEGA（vision5.