征求意见稿-人源微肿瘤PTC模型的要求

1T/CSBMEXXXX—XXXX人源微肿瘤PTC模型的通用要求本文件确定了人源微肿瘤PTC模型及其药敏检测操作程序和一般原则。本文件适用于利用人源微肿瘤PTC模型的基础科研、抗肿瘤药物研发、抗肿瘤药敏检测等方面。注：人源微肿瘤PTC模型适用于包括但不限于结直肠癌、胃癌癌、脑肿瘤、骨与软组织肉瘤、口腔癌、肾癌、前列腺癌等实体肿瘤类型。药物敏感向单药、免疫单药、新型药物（例如溶瘤病毒、细胞药物等）以及以上药物的组合。研发机构、临床检测机构和相关公司的研究人员、2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T38736—2020人类生物样本保藏伦理要求GB/T37864-2019生物样本库质量和能力通用要求中华人民共和国药典中华人民共和国人类遗传资源管理条例药物临床试验质量管理规范(GCP)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1微肿瘤PTCPatient-derivedtumor-likecellcluster全称患者来源类肿瘤组织细胞簇，是由患者来源肿瘤细胞、基质细胞（包括成纤维细胞、肥大细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、T细胞、B细胞等）在微肿瘤PTC专用培养基中低粘附培养，自发聚集形成的具有一定3D结构的细胞团，简称微肿瘤PTC。3.2知情同意Informedconsent有自主判断能力的供体或其法定监护人，在获得并充分了解样本和数据捐赠相关信息之后，供体所受到的风险最小，且没有受到任何利诱或恐吓等不当行为影响的前提下，自愿自主的捐赠个人生物样本及其关联数据，并与采集者/收集者共同签署的文件。[来源：GB/T38736—2020]3.3微肿瘤PTC培养基PTCgrowthmedium适合特定肿瘤细胞体外悬浮培养的无血清培养基，此培养基能够维持肿瘤细胞在体外的扩增培养，并在一定时期内保持多组分肿瘤基质细胞（包括成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、肥大细胞等）的存活。3.42T/CSBMEXXXX—XXXX3D细胞培养Three-dimensionalcellculture在特定培养基条件和培养容器中培养获得具有3D结构的细胞球体，此类培养能在一定程度上模拟体内生长环境。3.5细胞活力Cellviability在培养的微肿瘤PTC中，保持细胞增殖、代谢活性的活细胞的数量或比例。4缩略语H&E苏木精-伊红（Hematoxylin-eosinstaining）PBS磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline）IHC免疫组织化学（Immunohistochemistry）PCR聚合酶链反应（Polymerasechainreaction）NK自然杀伤（Naturekiller）HER2人表皮生长因子受体2（Humanepidermalgrowthfactorreceptor2）LGR5富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（Leucine-richrepeat-containingG-protein-coupledreceptor5）CEA癌胚抗原（Carcinoembryonicantigen）Ki67细胞增殖蛋白（Markerof(Kiel-67)）SNP单核苷酸多态性（Singlenucleotidepolymorphism）CNV拷贝数变异（Copynumbervariant）HBSSHank’s平衡盐溶液（Hank’sbalancedsaltsolution）HEPES4-羟乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonicacid）ROCKRho相关激酶（Rho-associatedcoiled-coil-containingprotein）MAPK促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinases）IL-15白细胞介素15（Interleukin-15）IL-2白细胞介素2（Interleukin-2）FGF成纤维细胞生长因子（Fibroblastgrowthfactor）EGF表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor）MSP膜支架蛋白（Membranescaffoldprotein）VEGF血管内皮生长因子（VascularendothelialgrowthfactorIGF胰岛素生长因子（Insulin-likegrowthfactor）BDNF脑源性神经营养因子（Brain-derivedneurotrophicfactor）HGF肝细胞生长因子（Hepatocytegrowthfactor）5人源微肿瘤PTC模型建立的一般流程5.1伦理要求人源微肿瘤PTC模型培养采用患者来源新鲜肿瘤组织，参照《中华人民共和国人类遗传资源管理条例》应当符合伦理原则。因此样本采集前应获得肿瘤样本供者的书面知情同意，明确供者和样本收集双方的利益和责任，知情同意的要求应符合GB/T38736-2020中5.3的要求。肿瘤样本提供者享有个人隐私权，其个人隐私信息的保密和保护应符合GB/T38736-2020中6的要求。3T/CSBMEXXXX—XXXX5.2肿瘤组织采集与送检（a）样本必须为含活的肿瘤细胞的、新鲜无污染的临床肿瘤样本。样本采集需在手术室或无菌环境下进行，避免微生物污染。取样过程需要患者在特定医疗机构进行，并由具有相应医疗资质且接受过取样操作培训的医护人员执行取样操作。（b）人源微肿瘤PTC模型培养需要从临床样本中获取不少于105的活细胞数量，因此对于临床采集样本大小有明确的标准规定，要求不同类型样本需满足相应样本标准，具体标准参考附录A。（c）实体肿瘤组织（手术样本、内镜/穿刺等活检样本）在采集后立刻放置于含5mL特殊保存液（参考附录B）的无菌保存管中。恶性肿瘤积液保存于无菌引流袋中。所有样本均需在低温（4℃-8℃)条件下保存和运输，24小时内送达实验室进行培养操作。（d）对样本采集、运输过程均需进行详细记录，记录应符合GB/T37864-2019中A.3、B.3条，宜记录的内容包括但不限于运送方式、运送过程中的温度，接受时温度或温度范围、运送起止时间和日期。（e）样本运输过程应注意防震、防摔和防泄漏，保护样本不发生外源性污染的同时，避免样本运输过程中对环境造成生物污染。5.3人源微肿瘤PTC模型构建、培养、鉴定以下所有操作均在无菌环境中进行。5.3.1样本组织的清洗采集的实体肿瘤组织需在无菌操作台中，用含有青霉素-链霉素的预冷的PBS缓冲液振荡漂洗，以去除表面污浊。液体样本无需此步骤。5.3.2样本组织的消化以及单细胞悬液的制备实体肿瘤组织样本需采用机械法和特制的组织解离液制备单细胞悬液，针对完成消化解离的实体样本单细胞悬液，用100μm的滤网进行过滤收集细胞悬液，具体操作步骤见附录C。针对液体样本，直接采用Ficoll密度梯度法分离收集肿瘤细胞，再用100μm的滤网过滤细胞悬液，具体操作步骤见附录C。5.3.3人源微肿瘤PTC模型的培养将过滤后的肿瘤组织单细胞以105个细胞/cm2的密度重悬于专用微肿瘤PTC培养基、并接种于低粘附孔板中，置于细胞培养箱（37℃,5%CO2）进行培养，并每隔2-3天进行补液或者换液。细胞培养2-7天，显微镜明场视野下观察肿瘤微球的形成情况。2-7天即可获得自组装的3D细胞微球（即微肿瘤PTC若7天内始终无肿瘤微球形成则表明培养失败。人源微肿瘤PTC模型构建流程如图1。人源微肿瘤PTC培养需采用特殊配置的无血清培养基，根据肿瘤细胞类型、多种基质细胞的生物学特征，配置特定PTC培养基。培养基要求详见附录D。4T/CSBMEXXXX—XXXX图1人源微肿瘤PTC模型构建流程图5.3.4人源微肿瘤PTC模型的鉴定见表1a光学显微镜明场视野下观察PTC细胞微每例样本必须检测常规光学显微镜(放大倍b微球细胞活力不低于90%每例样本必须检测细胞活力检测试剂盒等c大小、形状、细胞核等必须保证PTC每例样本必须检测由具有相应资质的病理d每例样本必须检测“1101无菌检查法”和“3301支原体检测法”e根据模型应用场景选择性开展该此建议根据肿瘤类型以及模型应用需要确定待f遗传特征（包括SNP和CNV）存在一定差根据模型应用场景选择性开展该患者原始肿瘤样本以及行全外显子测序和转录5T/CSBMEXXXX—XXXX6人源微肿瘤PTC模型的药物敏感性检测（a）在PTC肿瘤微球形成后一周内进行药物敏感性实验。（b）利用40μm滤网收集直径大于40μm的PTC微球，按照30-50个PTC微球/孔铺入96孔低粘附板中；（c）将含有抗肿瘤药物的PTC培养基（药物浓度依据研究需要）加到对应的实验孔中，每种药物设置不少于3个复孔，且每次试验均需设置未加药对照组（也需设置不少于3个复孔）。采用具备高分辨率的光学显微成像（放大倍数不低于40倍）系统获取每孔中PTC微球的图片。加药前用显微镜观察每孔样本状态，并在显微镜下拍照。（d）将培养板置于细胞培养箱（37℃,5%CO2）中继续培养。药物处理7天后，再次通过显微成像系统获取每个孔中PTC微球图片。（e）采用人工智能图像识别系统，分析加药前和加药后各培养孔中微肿瘤PTC面积的变化（PAi）来评估药效（图2）。（f）药敏结果计算：根据加药前后各孔位的微肿瘤PTC总的面积变化换算药物对微肿瘤PTC的杀伤百分比，从而判断药物的敏感性结果。图2微肿瘤PTC药敏检测体系药效评估指标PAi其中公式中SAi是指一个孔中PTC的面积，n指复孔的数量，t0和t1是指时间点。（g）药敏结果质量控制：当阴性对照（即未加药对照组）在第7天检测时PAi＜0.9（即未处理孔Day7细胞活力小于Day0表明微肿瘤PTC处于衰退期，则该样本的该次药敏检测实验结果均判定为无效。（h）药敏结果判定：药敏检测结果呈现形式为杀伤百分比（依据PAi数值进行换算），依据实验原理PAi在0~1时对应药物对细胞杀伤在100%~0%，PAi＞1则表明药物对细胞无任何杀伤（即耐药）。参考临床实体肿瘤疗效评估标准RECISTv1.1（肿瘤缩小30%为治疗缓解的标准）并结合PTC药敏临床研究结果设置药物敏感性的CUT-OFF值为30%（即PAi数值0.7）。当PAi＞0.7时（对应肿瘤杀伤百分比＜30%判定药物为无效杀伤（即药物不敏感）；当PAi≤0.7时（对应肿瘤杀伤百分比≥30%），判定药物为有效杀伤（即药物敏感）。7人源微肿瘤PTC模型的药物敏感性检测报告药物敏感性检测结束后，检测机构以纸质版和电子版报告形式将检测报告发送给患者或其医师。检测报告中应当明确展示出质检结果，包含收样情况、培养情况及微生物检测结果。药物敏感性测试实验结果以百分数的形式呈现，并以此划分杀伤效率及敏感性区分。8数据管理宜结合人源微肿瘤PTC模型的使用目的制订数据管理规范，至少应包括取样登记信息，组织细胞提供者的资料、肿瘤模型建立及鉴定、药敏检测结果等数据内容及保存时间、数据管理与使用的权限及责任。详细的临床样本数据管理可参照《药物临床试验质量管理规范》(GCP)中的数据管理部分内容。9废弃物管理在组织样本获取、人源微肿瘤PTC模型培养、药物敏感性测试等操作过程中产生的生物医学废弃物，应按照GB19489中7.19和GB/T38736中3.1的要求，遵循《医疗废物管理条例》丢弃到指定地6T/CSBMEXXXX—XXXX点妥善处置。对于使用过的人源微肿瘤PTC模型或不合格的人源微肿瘤PTC模型须严格按照生物样本处置与管理规范操作。7T/CSBMEXXXX—XXXX人源微肿瘤PTC培养样本采集标准人源微肿瘤PTC培养样本采集标准见表A.1。表A.111、离体30min内切取并放入样本保存23458T/CSBMEXXXX—XXXX人源微肿瘤PTC样本保存液人源微肿瘤PTC样本保存液见表B.1。表B.1PBS缓冲液、HBSS缓冲液、HEPES缓冲液、青霉素、链霉素、两性霉素样本保存液主要为支持组织样本在体外的葡萄糖运输、蛋白质和脂质合成，保9T/CSBMEXXXX—XXXX人源微肿瘤PTC培养单细胞悬液制备C.1组织解离液组织解离液配置见表C.1。表C.1HBSS缓冲液、胶原酶I、胶原酶II、胶利用酶溶液破坏细胞间质即细胞和胞外基质间的蛋白连接，释放组织样本的细胞间质对细胞的支C.2单细胞悬液制备操作以下操作均在无菌条件下进行：C.2.1实体组织样本单细胞悬液制备如下：1)组织样本放入10cm细胞培养皿中，用预冷且含有抗生素的5~10mLPBS或HBSS洗涤2-3次，弃去上清；2)在无菌操作台中，用眼科剪除去多余脂肪及结缔组织，再将样本机械剪碎成体积小于0.5mm3的小块；3)加入组织解离液（根据组织样本大小确定用量），充分吹散混匀组织小块；4)将组织样本液转移到15mL离心管中，37℃恒温箱孵育0.5-2小时；5)孵育期间每15分钟轻轻吹打混合，充分释放组织样本中的细胞，孵育时间仅供参考（具体时间应以消化过程中组织细胞离散程度来确定，因此在处理过程中需紧密观察）；6)镜下见大量细胞从组织块上脱落下来成为单细胞悬浮状态时，即加入细胞培养基终止样本处理；7)将处理好的单细胞悬液，用100µm的滤网过滤，随后在4℃、300g条件下离心10分钟收集细胞，用培养基重悬，完成单细胞悬液制备。C.2.2恶性积液样本的单细胞悬液制备如下：1)恶性积液在4℃、300g条件下离心5分钟，用PBS重悬细胞沉淀；2)轻轻地将细胞悬液加入淋巴细胞分离液（Ficoll）中，4℃、400g条件下离心20分钟，并降速设置为0；3)移走上层液体后，小心收集中间细胞层转入新的无菌离心管中，4℃、300g条件下离心5分钟；4)去上清后，加入培养基重悬细胞；5)将处理好的单细胞悬液，用100µm的滤网过滤，随后在4℃、300g条件下离心10分钟收集细胞，用培养基重悬，完成单细胞悬液制备。T/CSBMEXXXX—XXXX人源微肿瘤PTC培养基D.1人源微肿瘤PTC培养基配置见表D.1。表D.1培养基一（引自专利CN112760281B、CN112基础培养基：AdvancedDMEM/F1HEPES（终浓度：8-12mM）、GlutaMax（终浓度：0.8-1.2%，%表示体积百分含量）、人重组蛋白A83-01（终浓度：0.25-1.25μM）、N-乙酰-L-半胱氨酸（终浓度：0.5-2mM）、N-2Supplement培养基二（引自专利CN112760282B、CN112基础培养基：AdvancedDMEM/F1HEPES（终浓度：8-12mM）、GlutaMax（终浓度：0.8-1.2%，%表示体积百分含量）、人重组蛋白基础培养基：AdvancedDMEM/F1表示体积百分含量）、人重组蛋白EGF（终浓度：10-100ng/mL）、人重组蛋白bFGF（终浓度：基础培养基：AdvancedDMEM/F1HEPES（终浓度：8-12mM）、GlutaMax（终浓度：0.8-1.2%，%表示体积百分含量）、非必需氨基酸溶液（终浓度：0.8-1.2%，%表示体积百分含量）、人人重组蛋白bFGF(终浓度：10-50ng/mL)、人重组蛋白HGF（5-25ng/mL）、人重组蛋白FGF-10（终100-200ng/mL）、人重组蛋白R-spondin（终浓度：250SB202190（终浓度：5-10μM）、AB3-01（终浓度：0.25-1.25μM）、PrimocinT/CSBMEXXXX—XXXX基础培养基：AdvancedDMEM/F1人FGF-10（终浓度：5-25ng/mL）、人Wnt-3a(终浓度：200-300ng/mL)、人Noggin（终浓度：L-丙氨酰（终浓度：0.08-0.12mM）、L-天冬酰胺（终浓度：0.08-0.12mM）、L-天冬氨酸（终浓度：0.08-0.12mM）、L-谷氨酸（终浓度：0.08-0.12mM）、L-L-丝氨酸（终浓度：0.08-0.12mM）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（终浓度：1.6-2.4mM）、N-2（终浓度：0.8-1.2%，%表示体积百分含量）、B27（终浓度：1.5-2.5%，%表示体积百分含量）、ITS-X（终浓度：0.8-1.2%，%表示体积百分含量）、青霉素（终浓度：100-200U/mL）、链霉素（终浓度：100-200μg/mL）、两性霉素B（200-250ng/mL）、Primocin（终浓度：10-100μg/m基础培养基：AdvancedDMEM/F1（终浓度：5-20μM)、二氢睾酮（终浓度：1-10nM）、前列腺素E2（终浓度：1-10nM）、ITS-X（终浓度：0.8-1.2%，%表示体积百分含量）、青霉素（终浓度：100-200U/mL）、链霉素（终浓度：100-200μg/mL）、两性霉素B（200-250ng/mL）、Primocin（终浓度：10-10基础培养基：AdvancedDMEM/F1度：0.5-2mM）、烟碱（终浓度：5-10mM）、N-2（终浓度：1%，%表示体积百分含量）、霍乱毒素（终浓度：0.1-1mM）、B27（终浓度：1.5-2.5%，%表示体积百分含量）、ITS-X（终浓度：0.8-1.2%，%表示体积百分含量）、Y-27632（终浓度：5-基础培养基：AdvancedDMEM/F1浓度：0.8-1.2%，%表示体积百分含量）、人EGF（终浓度：10-100ng/mL）、人bFGF（终浓度：量）、Y276