《分子生物学技术》教学课件

第二节分子生物学技术第四章生物化学与分子生物学技术实践1.根据DNA复制的原理及过程，理解PCR技术的原理及过程。（重点）2.掌握PCR技术的基本操作。使用PCR仪的安全措施盖子样品池及池盖内高温、高压运行毛细管电源电源清洁PCR实验室里防护服防护手套所有的电源聚合酶链式反应程序DNA脱氧核苷酸脱氧核苷酸Taq聚合94℃解旋成为单链DNA40～60℃引物72℃4种脱氧核苷酸目的DNA片段的体外扩增5μL10×PCRdACP、dCTP、dGTP、dTTP1μL5μL5μL29μL5min2minTaq聚合酶94℃94℃30s56℃30s72℃30s72℃5min二苯胺试剂蓝色的深浅1．DNA扩增的变性过程中需要DNA解旋酶的参与。(×)【提示】是在94℃高温解链，不需DNA解旋酶的参与。2．DNA扩增退火过程中需要DNA聚合酶参与。(×)【提示】只需将温度降至40～60℃，使引物与模板配对。3．DNA延伸过程需要Taq聚合酶的作用。(√)4．所有PCR中使用的引物都是相同的。(×)【提示】引物的序列是依据被扩增区域的3′端边界DNA序列确定的。PCR技术的反应原理与反应过程

①如何理解PCR技术的反应原理？②怎样理解PCR的反应过程？3．PCR扩增的计算理论上DNA呈指数方式扩增。若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后有2n个；若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。实验操作的注意事项①实验操作应注意哪些问题？②PCR扩增成功的关键是什么？1．PCR所用的缓冲液配制一定要严格，或者直接购买专用扩增缓冲液。2．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、吸液枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。4．PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。5．PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。1.下列关于DNA复制叙述中，正确的是(

)。A．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链B．DNA复制不需要引物C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D．DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸解析本题主要考查了DNA聚合酶的作用特点。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链。由于模板链首先复制的是3′端，即复制方向3′→5′，而DNA分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向从子链5′→3′。答案C2.PCR利用了DNA热变性的原理，PCR仪实际上是一种能自动调节温度的仪器。下列对PCR过程中温度的控制的说法错误的是(

)。A．酶促反应需要高温，是为了保证模板是单链B．延伸的温度必须高于退火的温度，而低于变性温度C．要用耐高温的DNA聚合酶D．需要耐高温的解旋酶解析PCR是体外DNA扩增技术，DNA双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性。答案DA．向右的过程为加热(80～100℃)变性的过程B．向左的过程是DNA双链迅速制冷退火C．变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同D．图中DNA片段共有4个游离的磷酸基、4个3′端3.下图为DNA变性和退火示意图，下列相关说法正确的是(

)。解析变性后的DNA在缓慢降温后才会退火；变性与在生物体内解旋过程的条件不同，实质相同；任一DNA片段都有2个游离的磷酸基(5′端)和2个3′端。答案A4.PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链做模板时将(

)。A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链延伸D．无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链解析此题考查同学们对PCR反应中的变性、退火、延伸的实质能否真正理解。当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链做模板时，此单链引物端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即由引物Ⅱ结合延伸DNA子链。答案B5.在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题。

(1)在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。(3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点：________，循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为_____。(4)PCR反应过程的前提条件是________，PCR技术利用了DNA的________原理解决了这个问题。(5)在对样品DNA分析过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是______________。(4)DNA复制是以两条母链为模板，按照碱基互补配对原则进行的。因此，首先要解旋，使两条母链的碱基暴露出来，才能按照碱基互补配对的原则把相应