基因治疗课件

基因治疗

基因治疗基因治疗一、基因治疗的概念●基因治疗:指用(正常或野生型)基因导入人体的细胞，使其发挥生物学效应，从而达到治疗疾病目的的技术方法。●基因疗法-----在于后者的目的基因不与宿主细胞内的基因发生整合。基因治疗与基因疗法的区别

基因治疗基因治疗的类型生殖细胞基因治疗体细胞基因治疗基因治疗

目的基因的选择与制备受体细胞的培养载体的选择将目的基因导入靶细胞(导入方法的选择)

转导细胞的筛选和鉴定基因治疗的安全性监测和疗效评价基因治疗的基本程序

基因治疗二、基因治疗的基本程序

(一)目的基因的制备(方法)基因的克隆化基因的人工合成基因的PCR扩增人体基因组的降解

使用的目的基因的种类：染色体基因组、cDNA基因治疗(二)基因导入方式(方法)的选择按导入方式的不同，外源基因导入人体内的方法可分为3类：1.直接法(体内法)(invivo)

特点：直接向体内某组织(器官)转基因。

优点：操作简便；缺点：基因转移和表达的效率都较低。2.间接法(回输法)(exvivo)或称离体法特点：离体培养细胞，转基因后回输至患者体内。优点：成功率相对较高；缺点：操作繁琐。目前此类方法常用。3.原位法(insitu)直接向患者的病变部位转基因。基因治疗(三)基因导入的病毒学方法●目标基因导入靶细胞的方法分为两类：病毒学方法和非病毒学方法●病毒学方法(病毒介导的基因转移方法)

是指以重组病毒为载体，通过感染将目的基因导入靶细胞的方法。●常见的RNA病毒载体：逆转录病毒(retrovirus,RV)

慢病毒(lentivirus):也属于RV家族腺病毒(adenovirus,Ad)基因治疗1.逆转录病毒载体▼逆转录病毒的基因组结构及生活周期▼逆转录病毒科是RNA病毒的一个大科(可分7个属)。特点是具有二倍体基因，RV可将其基因组整合到感染细胞的DNA上▼基因组分为3个区：第1个区为LTR(含增强子、启动子、转录起始和终止信号)第2个区为ψ序列(其编码产物能有效包装病毒基因组进入病毒颗粒)第3个区含3个结构基因(gag、pol、env)RV的基因组结构见下图。基因治疗逆转录病毒的结构特征包装信号LTRψgagpolenvLTR调节和启动转录编码病毒核心蛋白等编码逆转录酶、整合酶等编码病毒外壳及包膜蛋白长末端重复序列基因治疗如莫洛尼氏鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：

LTRLTR

ψgagpolenvU5RU3U5RU3U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。Ψ=病毒包装信号，gag=核心抗原，pol=逆转录酶，env=外壳蛋白。基因治疗逆转录病毒的生活周期：基因治疗逆转录病毒载体的构建操作要点：▼切除野生型RV的结构基因(保留包装信号序列ψ)；▼在RV结构基因部位插入标记基因(如neo)和目的基因。基因治疗逆转录病毒载体的构建(续)常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)构建的各类逆转录病毒载体长末端重复序列包装信号LTRψ

gagpolenvLTR调节和启动转录标记基因目的基因基因治疗目前可供选用的逆转录病毒载体类型(略)基因治疗如何获得高效转染、高安全性的重组逆转录病毒？弄清下列几个概念：●逆转录病毒:指野生型RV●逆转录病毒载体:人工改造过的野生型RV●辅(助)病毒：即缺陷型逆转录病毒(含有完整的病毒结构基因序列，但缺失ψ及相关序列)。●包装细胞系：经辅病毒转染且整合了辅病毒缺陷基因的哺乳动物细胞系(包装细胞自身不产生病毒颗粒)。●重组逆转录病毒：含病毒结构蛋白,但不含病毒核酸。基因治疗重组逆转录病毒：

经包装细胞系产生的含有病毒结构蛋白，但其RNA(由目的基因及标记基因转录合成)不含病毒蛋白的编码序列，仅有一次感染能力的逆转录病毒颗粒。

重组逆转录病毒被称为假病毒颗粒。基因治疗

假病毒颗粒的产生并感染靶细胞

逆转录病毒载体重组逆转录病毒

(核酸部分只能是逆转录病毒载体)

LTRψ

标记基因目的基因LTR1LTRgagpolenvLTR辅病毒2Gag蛋白PoL蛋白Env蛋白包装细胞系35LTR标记基因目的基因LTR靶细胞4包装的病毒颗粒,其RNA系标记基因和目的基因的转录产物，但不含病毒蛋白的编码序列。基因治疗2、腺病毒载体(略)

(四)基因导入的非病毒学方法1、脂质体法脂质体：指人工制造的具有磷脂(脂质)双层包膜的脂质小囊，无毒、无免疫原性。脂质体分两类：1)普通脂质体。其作用无特异性，应用受限制。基因治疗2)多态性脂质体▼

这类脂质体与核酸和细胞膜有高度反应性且不易被免疫系统识别摄取。▼目前普遍使用的阳离子脂质体lipofectin和lipofectamine(商品名)其转染细胞的效率比一般的脂质体要高几个数量级。▼脂质体法转染率低、转移的基因表达时间短暂。基因治疗2、直接注射法3、受体介导的基因转移技术4、其他方法如DNA磷酸钙共沉淀法;电穿孔法(电脉冲介导法);显微注射法;颗粒(微粒子)轰击法;DEAE–Dextran法等等应该注意，逆转录病毒介导的基因转移是至目前为止转染效率最高、成功率最高、应用最广的一种基因转移方法。基因治疗(五)靶细胞的选择目前基因治疗的靶细胞仅限于体细胞。作为基因治疗的受体细胞(靶细胞)的条件：容易取出容易培养对逆转录病毒载体的感染比较敏感容易移植寿命较长或自新功能数量足够基因治疗常用的靶细胞的种类1.造血细胞(造血干细胞)2.皮肤成纤维细胞

3.肝细胞4.血管内皮细胞

5.淋巴细胞

6.肌肉细胞

7.肿瘤细胞

8.其他细胞基因治疗(六)转染细胞的筛选和导入基因的鉴定1、转染细胞的筛选为何要进行筛选?(细胞形态、转染率)利用载体上抗药性的标记基因，如新霉素磷酸转移酶基因(neo)进行筛选，只是筛选方法中的一种，称为标记基因技术。此外还有基因缺陷型受体细胞的选择基因共转染技术分子杂交技术∴∵

基因治疗新霉素抗性选择系统

----G418筛选原理▲

新霉素是细菌抗生素,可干扰原核生物的蛋白质合成,但对真核细胞则无影响。▲

G418是新霉素的类似物，对原核和真核细胞均有毒性。▲

用具有磷酸转移酶基因(neo)的表达载体转染

真核细胞,若neo基因与能有效转录的真核DNA序列连锁时,就能获得有效表达,从而产生新霉素磷酸转移酶使G418失活。显然,当真核细胞转入neo基因后，就会在含G418的选择性培养基中存活，而未转入neo基因的细胞则不能生存。基因治疗2、导入基因的鉴定

直接对转染细胞的外源基因(目的基因)的存在与否或对其表达产物的含量与活性进行鉴定。方法：PCRRT-PCRNorthern印迹免疫组化(染色)免疫印迹等等。基因治疗(七)基因治疗临床试验的审批(略)三、基因治疗的主要策略和技术方法(一)基因治疗的主要策略1、基因标记实验(略)基因治疗2.基因置换(基因矫正)有两种含义:其一,指将致病基因整个地以正常基因置换，使致病基因永久性得到更正；其二，指对缺陷基因的异常序列进行精确的原位修复但不影响邻近的基因。基因定点突变、定点敲除和定点修复均属于基因打靶(genetargeting)技术。

目的基因靶细胞染色体

(正常基因)

同源DNA序列

(缺陷基因)

同源重组基因治疗3、基因添加又称基因增补或基因修饰：在不去除异常基因的前提下，

将目的基因导入病变细胞或其他细胞(非定点整合)，以目的基因的表达产物来补偿缺陷基因的功能或使原来的功能得到加强。例如，把细胞因子(如TNF)基因导入肿瘤细胞并使其表达即属此类。基因添加是目前基因治疗应用较多的策略。基因治疗4、基因干预●基因干预

是指采用特定的手段，抑制或阻断某个基因的表达。●基因干预的靶：过度表达的癌基因、病毒复制周期的关键基因。●基因干预的技术方法：反义核酸技术核酶技术反义核酸-核酶技术细胞内抗体(intrabody)技术等等。基因治疗(二)基因干预主要有以下几种方法弄清以下几个概念：反义技术(antisensetechnology)

研究和设计有效抑制靶基因表达以控制和治疗疾病的人工反义分子的专门技术。

一般要满足以下3个条件：

(1)能特异地识别靶基因的序列并与之结合；(2)在细胞内不易被酶解，存留时间较长；

(3)能透过细胞膜到达作用部位。基因治疗反义核酸(antisensenucleicacid)指与细胞内DNA或RNA序列相互补形成杂交体而阻断或减弱其转录和翻译过程的DNA片段或RNA片段。目前研究较多的反义核酸有反义寡核苷酸(ODN)

反义RNA(antisenseRNA)

核酶(ribozyme)基因治疗1、反义RNA技术反义RNA结合于细胞中特异mRNA的特定部位(如UTR)，可抑制有害基因的表达。反义RNA的应用方法：

(1)体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞；(反义RNA序列设计原则？)(2)构建表达(转录)反义RNA的重组体，并导入细胞，转录出反义RNA而发挥作用。

(人工构建反义表达载体注意事项?)基因治疗ODN与mRNA结合后抑制后者的翻译(反义核酸技术)；ODN+dsDNAtsDNA(三链技术)反

基因ODN+dsDNA中的ssDNAdsDNA技术抑制DNA的复制与转录反义核酸技术的二大问题解决办法(1)反义核酸在靶细胞中定位

受体介导转移核酸(2)被内源性核酸酶降解

改造核苷酸的结构基因治疗2、核酶(ribozyme)技术具有酶促活性的RNA称为核酶。四膜虫rRNA的自我剪接rRNA的剪接采用自我剪接方式基因治疗最简单的核酶二级结构——锤头状结构

(hammerheadstructure)

底物部分基因治疗核酶催化部份和底物部份组成锤头结构能进行分子内自我催化的RNA片段不很长，通常为60个核苷酸左右。同一分子上包括有催化部份和底物部份。核酶催化作用的特点

(1)都有一个活性中心，催化时形成中间复合物，具有比蛋白质酶更高的底物特异性；

(2)核酶对底物的切点处序列普遍为

CGU-X(含有 GU序列)。

G基因治疗

人工设计的核

酶

黄粗线表示合成的核酸分子黑细线表示天然的核酸分子X表示一致性序列箭头表示切断点基因治疗核酶在基因治疗中的应用▼核酶(RNA)分子活性中心必需基团为必不可少的高度保守序列，其两端与底物RNA互补的片段则为结合基团。▼在设计人工核酶时，可据靶核酸序列特点，灵活改动与底物结合的两段序列。▼核酶结构稳定，不易被RNase降解，且可反复发挥作用，其应用日益受到重视。▼如用核酶在培养的白血病细胞中干预癌基因Ha-ras的表达等已见报道。基因治疗RNA干涉(扰)(RNAinterference,RNAi)

(补充)RNA干涉(扰)是近年发现的一种序列特异的转录后基因沉默现象。其原理简单地说，RNAi是由双链RNA启动，导致具有同源序列的mRNA降解。特点与用途：是一项快速有效的、适宜高通量、在基因组范围进行基因功能分析的强有力技术。基因治疗RNAINTERFERENCE

>30basepairdouble-strandedRNACleavagePKRinactivePKRactive2’,5’-ASinactive2’,5’-ASactive(GlobaleffectsInhibitionofproteinsynthesisDegradationofmRNAsShortinterferingRNAs<30basepairsRailDegradationofmRNA(Sequence-specificeffects)基因治疗3、自杀基因技术原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。自杀基因:前体药物酶转化基因基因治疗自杀基因(suicidegene)的功能如下图所示：

细胞药物前体自杀基因

+

病毒载体

(无毒)

转染

重组载体

gene

酶

药物复合物

(有毒)

细胞死亡基因治疗

自杀基因应用举例：

单纯疱疹病毒哺乳动物细胞

HSVGene-TK

（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）Gene—TKGCV（胸苷类似物）

ATPTdRTKATPGCV---pTK抑制DNA合成

TdR-5’-P肿瘤细胞死亡(脱氧胸苷酸)

邻近细胞死亡凋亡（旁观者效应）另一自杀系统(E.coli):CD/5-FC(略)。基因治疗四、遗传病的基因治疗前言：人类遗传变异4000多种；其中遗传病约3000种。当前，以基因治疗方法医治的单基因缺陷遗传病有:

85％患者

ADA缺陷病SCID

囊性纤维变性家族性高胆固醇血症血友病B

粘多糖沉积症等等。基因治疗(一)腺苷脱氨酶(ADA)缺陷病的基因治疗1.腺苷脱氨酶缺陷病的分子机制人腺苷脱氨酶(adenosinedeaminase,

ADA)的基因定位

ADA基因定位于染色体20q12-q13.11，基因全长32kb(含12个外显子、11个内含子)，

mRNA长1530bp(翻译产物ADA含362个aa残基)。基因治疗ADA缺陷导致SCID的分子机制腺苷脱氨酶（ADA）和嘌呤核苷

磷酸化酶（PNP)缺陷引起的SCID

ADA或PNP缺失导致dATP或dGTP在细胞内积蓄，对早期T、B细胞发育有毒性作用，使之停滞于pro-T/pro-B阶段，引起SCID.基因治疗AMP

IMP

腺苷肌苷

PNP腺苷

脱氧腺苷dAMPdADPdATP抑制核苷酸还原酶T、B细胞增殖障碍6-氧嘌呤GMP鸟苷PNP鸟嘌呤黄嘌呤鸟苷脱氧鸟苷dGMPdGDPdGTP尿酸ADA抑制脱氧核苷酸合成进而抑制DNA合成基因治疗网状细胞发育不全造血干细胞

髓红系干细胞SCID淋巴干细胞前B细胞

前T细胞

SCID胸腺B淋巴细胞浆细胞免疫细胞分化途径记忆B细胞T淋巴细胞(部分)与免疫缺陷严重联合型免疫缺陷(SevereCombined

Immunodeficiency，SCID)基因治疗2.ADA缺陷病的基因治疗研究用RV载体转染高效表达+SV40启动子重组体小鼠、人淋巴细胞持续数月+ADA基因(体外培养)ADA缺陷基因治疗的早期实验研究(Culveretc.)

基因治疗第二个时期(Farrarietc.)用RV载体将人ADA基因导入体外培养的小鼠外周血淋巴细胞，然后回输给ADA缺陷小鼠的血液系统(结果：小鼠血中出现Ig及抗原特异性T淋巴细胞)基因治疗第三个时期(Kantoffetc.)用RV载体将人ADA基因导入猴的骨髓造血干细胞，然后回输到被放射性破坏造血系统的猴的体内.(结果：实验猴均重建造血系统，有ADA基因表达，动物存活9个月以上，且具无并发症的安全性)。通过上述三个时期的实验研究和实验资料的积累，足可过渡到临床基因治疗。基因治疗3.ADA缺陷的临床基因治疗ADA-gene+vector（逆转录病毒）

重组分子患者TLyC

IL-2刺激C分裂

导入生长、分裂的细胞

10天

ADAgene表达

回输患儿体内

1~2月治疗一次,10.5个月后患儿体内ADA水平达正常人的25%

基因治疗(二)血友病B的基因治疗(略)(三)家族性高胆固醇血症的基因治疗(略)五.肿瘤的基因治疗疾病本身的特殊性决定治疗方法和手段的特殊性目的基因和靶细胞的选择:受限制少、灵活；治疗的策略多样性；。一般地，按作用机制，肿瘤基因治疗策略分为三大类:基因治疗(一)抑制和杀伤肿瘤细胞自杀疗法早期研究将自杀基因(如药物前体转化酶的基因)导入肿瘤细胞，该基因产物能使无毒的药物前体转变为细胞毒性药物，从而使肿瘤细胞‘‘自杀’’。应指出，上述实验的对象是体外培养的肿瘤细胞。特点：在人和动物体内，很难保证自杀基因的组织特异性表达。基因治疗自杀基因在肿瘤组织中的特异性表达AFPgenepromoter重组包装细胞系假病毒+VZV-tk(目的基因)逆转录病毒颗粒+RV载体