《高粱属品种鉴定 InDel分子标记法（征求意见稿）》编制说明

地方标准编制说明一、目的意义简述产业发展现状，制定标准的必要性、可行性，预期经济社会效益分析等。植迅猛发展。高粱种植面积在2015-2021年间增幅58.86%，年均复合增长率约江苏作为我国酿酒产业强省之一，对高粱需求量大、品质要求高。江苏省相较于SSR分子标记，InDel标记分辨率和精准度更高、鉴定周期更短。SSR（Simplesequencerepeats）作为基因组遗传特征并广泛用于遗传多样性分析，而SSR分子标记法仍存在片段差异小、优势在于：1).与目标基因功能关联，更利于分子辅助筛选和鉴定；2).可筛选片段差异大于50bp，便于分离和精准鉴定；3).分离方式可使用最常见的琼脂糖电原料分子鉴定技术规程，而SSR分子标记法分辨率低、分析周期长的缺点一定分子标记，为我省高粱属品种分子鉴定及品种权保护提现代分子遗传研究方法可直接比对出基因InDels。2021年权威期刊Nature色体的yellowseed1基因编码的MYB转录因子中存在大片段插入，造成不同高粱种质内外种皮颜色显著变异。因此，依据泛基因组分析设计重要性状的InDel1.制定高粱属的InDel分子标记品种鉴定方法，将更加有效地保护育种者bigdataNew/home/ManageOrg当前高粱品种活跃。高粱属InDel分子标记品种鉴定方法将为品种DUS测试过程中的近似品种筛选、特异性辅助判定提供快速手段。2.制定高粱属的InDel分子标记品种鉴定方法，将为规范高粱属种业市场3.制定高粱属的InDel分子标记品种鉴定方法，将为高粱实质性派生品种基因型或者基因型组合产生的基本性状方面与原始品种相同。InDe种鉴定方法可为快速分析遗传亲缘关系，利二、任务来源说明项目来源文件。本标准研制任务由江苏省农业农村厅提出，根据《省市场监管局关于下达三、编制过程按时间节点或工作进度简述编制过程。对已发表的13个参考基因组进行大片段比对并筛选片段>25bp的高性缺失位点，并依据染色体物体图谱均匀分布的筛选原则，共计获得有效InDel对276份高粱属种质DNA等份混合获得12个基因池，筛选560个InDel行分析，获得遗传多样性矩阵。进行聚类等差异分析后发现，可完全区别276依据高粱属Harlen&Wet的Bicolor/Caudatum/Durra/Guinea/Kafir分类法，苏地方种和苏丹草2098。对以上60对核心InDel引物的6个代表性种质PCR扩机构等方面20位高级职称专家意见，共收到100条，采纳58条，部分采纳8四、主要内容技术指标确立简述标准主要内容技术指标确定的依据，包括实地调研、查阅资料、试验论证等。标记法总则》标准编写要求，采用以下原则编写《高粱属品种鉴定InDel分子规范性原则：本标准的制定符合法律法规，符合有关标准要求，包括GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》、GB/T组二态性、大片段、高频InDel位点并开发InDel标记，荧光毛细管电泳的高粱属鉴定技术，证明采用InDel标记技术检测高粱属品种真法简便、时间短、数据统计分析简单、易实现数据（二）标准主要内容因高粱种子粉末内淀粉和蛋白质含量过高，常规的CTAB法提取后的DNA图1CTAB法和SDS法提取高粱种子DNA后的电泳比较。利用已发表13个高粱属不同种质基因组序列与高粱测序品种BT×623参考基因组序列进行比对。利用软件MUMmer进行大片段同源序列比对筛选目标区本标准自主开发了一种快速预测Indel标记最小等位基因频率的方法，混池样品，再分别对N个混池DNA进行特异引物的PCR，所得N个产物二次条带强弱进行量化分析后，计算MAF（%）=Intensity(弱带)/[Intensity(弱图2高粱属Indel标记MAF预测流程。利用筛选出的111对高频InDel引物对276份高粱种质DNA进行逐一分析，依据其二态性获得遗传多样性矩阵，并利用Neighbor-joining(NJ)聚类法构建系统SS物的区分力足以辨别276份高粱属种质，特认定为核心引物，编号WS01-60。此外，将核心60对引物数量将至30个后的高粱属种质遗传多样性矩阵进一步构建NJ系统发育树，如图3-C所示，出现了除JS172VSJS172_2对照外的大量种质重复，说明缩减60对核心降低了种质区分力。分别对以上60对引物的扩增产物进行Sanger双向测序后并BLAST高粱属测序品种BT×623参考基因组，确认其扩增序列染色体物理位置与设计位置相符。>2，判定为“不同”。图3高粱属276份种质的系统发育树对比。 —0 5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 7580Chr.01STARTWS01WS02WS03WS04WS05WS06EndChr.02STARTWS07WS08WS09WS10WS11WS12EndChr.03Chr.04STARTWS19WS20WS21WS22WS23WS24EndChr.05STARTWS25WS26WS27WS28WS29WS30EndChr.06STARTWS31WS32WS33WS34WS35WS36EndChr.07STARTWS37WS38WS39WS40WS41WS42EndChr.08Chr.09Chr.10STARTWS55WS56WS57WS58WS59WS60EndSTARTWS13WS14WS15WS16WS17WS18EndSTARTWS43WS44WS45WS46WS47WS48EndSTARTWS49STARTWS13WS14WS15WS16WS17WS18EndSTARTWS43WS44WS45WS46WS47WS48EndSTARTWS49WS50WS51WS52WS53WS54End对核心引物的荧光毛细管电泳单峰比较如7所示，所得PCR产物大小与Sanger图5高粱属60对核心Indel标记的琼脂糖电泳条带图。图6高粱属Indel标记毛细管荧光电泳全谱比较。图7高粱属60对核心Indel标记的毛细管荧光电泳单峰比较。表1高粱属60对核心Indel标记遗传多态性。引物名称染色体位置参照品种InDel位点多态性（bp）MAF(%)BTx623RioTx430红缨子甜高粱地方种a苏丹草/b苏牧3号1WS011a115043.11WS021241428428428428a42826.11WS031778778529529529a77827.51WS041816816816816816b3282.81WS051477477477a115335.92WS061301301259301301a3011WS072351296296296296a29625.01WS082283496283496496a49633.31WS092a13228.61WS102243243243590590a24339.51WS112277501277501/a27748.91WS122814814814515515a81423.91WS133278278355355355a3551WS143689418689418689ac418/68946.31WS153257529529257529a25732.61WS163567a1952WS173426a114140.02WS183959959644959959a95949.32WS194209a20944.91WS204a15827.51WS214302302302219219a30240.21WS224539310310310310a53930.81WS234435435a43529.31WS244263486486486486a48629.72WS255406a1901WS265a12326.11WS275264362362264362a26443.52WS285a8791WS295531531531a1701WS305211247211247247a21142.01WS316500500500500a1491WS326491658658658658a65825.71WS336257257257502502a25743.81WS346597362362362362a3621WS356a12823.61WS366498a1531WS377885885885a15637.31WS387298298485298298a2988.71WS3971005a1561WS407300300300300300a3486.91WS417396396396335335a33549.31WS427225225458225225a22521.01WS438422422a18449.32WS448a25638.81WS458373373373a37327.51WS468418418418a17244.61WS478416416a4161WS488833833599599599a5991WS499353353353a35340.61WS509a1831WS519435435435435435a1985.41WS529428660428428660a42847.52WS539a16248.21WS549207553207207207a55326.81WS5510361036373373373a103626.81WS56235235235481235a23544.31WS57644644644976976a64445.81WS58686868a117627.11WS59332332332332565a33237.31WS60423423423304423a42342.0总计29.21