分子生物学第五章2

第四节转录的机制转录是由DNA指导的RNA合成过程，可分为起始(initiation)、延伸(elongation)和终止(termination)三个阶段。对转录的调控主要发生在起始和终止阶段，其中转录起始的调控是转录过程乃至整个基因表达过程的中心环节。一、转录的起始转录的起始是RNA聚合酶识别启动子并与之结合从而启动RNA合成的过程。转录的起始过程十分复杂，特别是真核生物，需要多种辅助因子参与。Activationofgenestructure↓Initiationoftranscription↓Processingthetranscript↓Transporttocytoplasm

↓TranslationofmRNA1.原核生物转录的起始菌体细胞中，大部分的RNA聚合酶（核心酶）与DNA分子松弛结合，形成松弛型复合物，并且核心酶对启动子无特殊的亲和力。σ因子与核心酶结合形成全酶以后，对启动子的亲和力大大提高，形成紧密型复合物。原核生物RNA聚合酶中的σ因子起着识别启动子的作用。全酶在很长的基因组中寻找约60bp的启动子是一个很复杂的过程。目前有三种模式解释这种机制：随机扩散模式序列置换模式滑动模式RNA聚合酶与启动子－35区结合后，与DNA形成封闭型启动子复合物，然后－10区左右的DNA发生熔解，形成12～17bp的单链区，转变为开放型启动子复合物。二者皆为二元复合物，此时RNA聚合酶大约与75bp的DNA相接触。在开放型启动子起始复合物中，RNA聚合酶的起始位点和延伸位点被相应的核苷酸前体所占据。在β亚基的催化下，起始位点和延伸位点上的核苷酸形成第一个磷酸二酯键，从而形成一个三元复合物。σ因子从三元复合物上解离下来，形成起始延伸复合物（initialelongationcomplex），此时与大约50bp（－35～＋20）的DNA相互接触。原核生物转录的起始1.全酶与模板的DNA接触，生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动；2.起始识别：全酶与－35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物（closedbinarycomplex）；3.全酶紧密地结合在-10序列处，模板DNA局部变性，形成开放的启动子二元复合体；4.第一个rNTP转录开始,形成酶-启动子-rNTP三元复合体（ternarycomplex）。5.当RNA长约9bp形成稳定的DNA-酶-RNA复合物、σ因子释放，结束起始，进入延伸阶段。σ因子释放是起始与延伸的分水岭。2.真核生物转录的起始RNA聚合酶Ⅰ的转录起始RNA聚合酶Ⅰ起始转录需要两种辅助因子UBF1和SL1的参与。

UBF1可特异地识别核心启动子和上游调控元件（UpstreamControlElement）中富含GC对的区域。在UBF1和DNA结合以后，SL1才可结合上来。SL1类似于原核生物的σ因子，它可与启动子特异地结合，并保证RNA聚合酶Ⅰ定位于转录起始位点。当两种辅助因子与DNA结合以后，RNA聚合酶Ⅰ才能与核心启动子结合，从而起始转录。RNA聚合酶Ⅱ的转录起始RNA聚合酶Ⅱ自身不能起始转录，必须在其他辅助因子的作用下，RNA聚合酶Ⅱ和其他辅助因子组成一个基础转录装置（basaltranscriptionapparatus），起始真核生物Ⅱ类基因的转录。RNA聚合酶Ⅱ可以起始转录的最短的启动子序列称为通用启动子（genericpromoter），它可以在任何细胞内表达而无组织特异性。能使通用启动子起始转录所需的辅助因子，称为基础转录因子（basaltranscriptionfactor，TFⅡX）。通用启动子起始转录的效率很低，需要上游的调控序列及相应的辅助因子来增强其转录的水平。RNA聚合酶Ⅱ转录起始的过程需要很多辅助因子的参与，它们按一定的顺序与DNA结合形成复合物。经足迹法可证明各种辅助因子与DNA结合的先后次序。识别TATA框及其上游序列的辅助因子称为TFⅡD。TFⅡD由TBP（TATA-bindingprotein，TBP）及TBP相关因子（TBP-associatedfactors，TAFs）两种组分组成。TBP识别TATA框。含不同TAFs的TFⅡD可以识别不同的启动子。人类Ⅱ型启动子的转录因子 因子 分子量 功能 RNAPolⅡ≥10K 依赖模板合成RNA TFⅡA 12,19,35K稳定TFⅡD和DNA的结合，激活TBP亚基 TFⅡB 33K 结合模板链（-10～+10），起始PolⅡ结合，和TFⅡE/F

相互作用 TFⅡD (TBP,30K)TBP亚基识别TATA，将聚合酶组入复合体中，TAFs识别特殊启动子 TFⅡE 34K(β)结合在PolⅡ的前部，使复合体的保护区延伸到下游

57K(α)TFⅡF 38,74K 大亚基具解旋酶活性（RAP74）,小亚基和PolⅡ结合，介导其加入复合体 TFⅡH 具激酶活性，可以磷酸化PolⅡC端的CTD，使PolⅡ逸出，延伸 TFⅡI 120K 识别Inr，起始TFⅡF/D结合 TFⅡJ 在TFⅡF后加入复合体，不改变DNA的结合方式 TFⅡS RNA合成延伸 转录起始复合物形成的基本过程为TBP及TAFs先与TATA框附近的区域结合，而后依次为TAⅡA、TAⅡB、TAⅡF和RNA聚合酶、TAⅡE、TAⅡH和TAⅡJ。TBP与DNA的小沟结合，这和其他的蛋白因子不同，目前所知的所有蛋白质因子都是与DNA的大沟结合。TBP是唯一的一个与DNA特异结合的基础转录因子。TBPinTFIIDbindstotheTATAboxTFIIAandTFIIBarerecruitedwithTFIIBbindingtotheBRERNAPolII-TFIIFcomplexisthenrecruitedTFIIEandTFIIHthenbindupstreamofPolIItoformthepre-initiationcomplexPromotermeltingusingenergyfromATPhydrolysisbyTFIIH)PromoterescapesafterthephosphorylationoftheCTDtail经分析，TBP的晶体结构呈马鞍状,内面与DNA结合，外面与其他的蛋白因子相互作用。TFⅡD具有识别TATA框的作用，TFⅡD结合上来以后形成的复合物可保护－45～－10的区域。TFⅡA由几个亚基组成，可以激活TBP。它的结合可使复合物的保护区域扩展。TFⅡB与TATA框的下游结合，可使复合物的保护区域扩展至＋10。TFⅡF由两个亚基组成，大亚基具有依赖ATP的DNA螺旋酶的活性，可能参与DNA双链的熔解。小亚基与RNA聚合酶紧密结合。TFⅡF的功能是将RNA聚合酶Ⅱ于其他的辅助因子组成转录复合物。TFⅡF的结合可使复合物的保护区域扩展至＋30。TFIIE由两个亚基组成，分别为34Kda和56Kda，两个亚基对RNA聚合酶的结合和转录激活都是必需的。TFⅡH和TFⅡJ与复合物的结合并不改变复合物与DNA间的作用模式。

TFⅡH具有激酶的活性，可使RNA聚合酶Ⅱ的CTD尾磷酸化，结果可使聚合酶与其他的转录起始因子解离，从而得以进行转录的延伸。RNA聚合酶Ⅱ的起始过程类似于原核生物，先由RNA聚合酶和DNA形成封闭型复合物，DNA解链后形成开放型复合物。ATP可能与某些转录因子从复合物上解离有关。真核生物共计有20多种多肽分子参与RNA聚合酶Ⅱ转录起始过程，形成的起始复合物十分庞大，总计在1000KDa以上。真核生物RNA聚合酶Ⅱ的启动子结构中还有其他的元件如CAAT框、GC框和八聚体元件。对各种元件的识别都需要特有的转录因子，如SP1可识别GC框、CAAT框由CTF家族的因子识别、识别八聚体元件的蛋白质因子不止一种，在非淋巴细胞中为oct-1，而在淋巴细胞中为oct-2。至于这些元件的识别与转录起始复合物形成的关系，目前还不十分清楚。RNApolII催化的基因转录的全过程

RNA聚合酶Ⅲ转录的起始RNA聚合酶Ⅲ转录基因的启动子有三类，其中有两类属于内部启动子。这两类内部启动子转录的起始需要三种辅助因子TFⅢA、TFⅢB和TFⅢC的参与。TFⅢB含有TBP，是RNA聚合酶Ⅲ所需要的真正转录因子，其主要作用是使RNA聚合酶Ⅲ正确定位于启动子上。而TFⅢA和TFⅢC属于装配因子，起协助TFⅢB与启动子正确结合的作用。RNA聚合酶Ⅲ的第三类启动子（snRNA）不是内部启动子，其结构类似于RNA聚合酶Ⅱ的启动子。RNA聚合酶Ⅲ对其TATA框的识别同样依赖于TBP，但必须有其他RNA聚合酶Ⅲ的辅助因子共同作用，使RNA聚合酶Ⅲ在启动子上正确定位。RNA聚合酶Ⅲ并没有对启动子特异序列的识别作用。它能正确地结合在转录起始点附近，全靠其他转录因子的作用。RNA聚合酶III可以在仅有TATA元件的情况下从上游启动子起始snRNA基因的转录。在TATA元件上游，PSE元件和OCT元件的出现会大大增加基因的转录效率。结合在PSE和OCT元件上的蛋白因子之间会发生协同作用。TBP在三种RNA聚合酶的转录起始中均有相同的作用。在RNA聚合酶Ⅰ识别rRNA的启动子并起始转录的过程中，TBP是SL1的组分，起定位RNA聚合酶Ⅰ的作用。在RNA聚合酶Ⅱ的转录起始过程中，TBP可以识别TATA框，同样起定位RNA聚合酶的作用。

RNA聚合酶Ⅲ的转录起始（包括内部启动子）也需要TBP。尽管TBP在不同的启动子中与其他转录因子形成复合物的方式不同，但功能都是一样的，即起定位作用。所以TBP又称为定位因子（positioningfactor）。二、转录的延伸转录的起始第一个涉及的问题是第一个碱基的选择。在原核生物，起始转录的碱基距保守T为6～9个核苷酸，多为CAT模式，第一个碱基为A，这可能是由RNA聚合酶的空间结构决定的，即结合部位与聚合活性部位间的距离决定了转录起始碱基与TATA框（结合位点）的距离。原核生物的RNA聚合酶中，催化RNA合成的可能是β亚基。在酶分子上有两个核苷酸结合位点，一是起始核苷酸位点。二是延伸核苷酸位点。当两个位点都与模板互补的核苷酸结合后，第一个磷酸二酯键才能形成。转录起始后，σ因子解离下来，这时的核心酶既能够与DNA结合，又能在DNA分子上滑动。真核生物是靠多种辅助因子的共同作用来维持这一状态的。转录的延伸过程中，需要旋转酶（gyrase）和拓扑异构酶Ⅰ（topoisomeraseⅠ）消除正超螺旋和负超螺旋。新形成的RNA链与DNA形成的杂交双链很短，只有几个碱基(<3bp)。RNA合成的速度约为每秒40个核苷酸，与蛋白质合成的速度相近（15个氨基酸/秒），但比DNA复制的速度要慢得多。另外，RNA聚合酶在DNA分子上的运动不是匀速的。Transition

fromtheinitiationto

elongationinvolvesthePolIIenzymeshedding(摆脱)mostofitsinitiationfactors(GTFandmediators)andrecruitingotherfactors:(1)Elongationfactors:factorsthatstimulateelongation,suchasTFIISandhSPT5.(2)RNAprocessing(RNA加工)factors

RecruitedtotheC-terminaltailoftheCTDofRNAPIItophosphorylatethetailforelongationstimulation,proofreading,andRNAprocessinglikesplicingandpolyadenylation.RNAprocessingenzymesarerecruitedbythetailofpolymerase三、转录的终止

转录进行到终止子序列时，就进入了终止阶段，包括新生RNA链的释放及RNA聚合酶与DNA的解离。1.转录终止的机制原核生物的终止子有两种，一种是不依赖ρ因子的终止子，一种是依赖ρ因子的终止子。在不依赖ρ因子的终止子中，转录的终止依靠终止子本身的结构就足以使转录终止。ρ因子可以与新生RNA在终止子上游的某一处与RNA结合，这种结合可能需要某种特异的序列。ρ因子有依赖RNA的ATPase活性，RNA的长度要大于50nt，这说明ρ因子要与RNA结合。强终止子的结构特点

(1)有回文结构存在；（2）茎的区域富内含G-C；

(3)强终止子3′端上有6个U；

以上结构特点在终止中起何作用？ρ因子沿RNA链移动的速度比RNA聚合酶在DNA链上的移动速度快，聚合酶在终止子处的暂停给ρ因子赶上RNA聚合酶提供了机会。ρ因子可使转录泡的RNA-DNA解链，然后RNA聚合酶释放，转录终止。在原核生物中，转录和翻译是同时进行的，ρ因子的终止作用可因核糖体的存在而阻碍。RNA分子中的二级结构也可阻止ρ因子的作用。真核生物同样存在终止子的结构在RNA聚合酶Ⅰ的终止过程中，需要一个辅助因子识别一个18bp的终止子序列。RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ的终止子与原核生物不依赖ρ因子的终止子结构类似，可能也具有类似的终止机制，终止可能靠RNA聚合酶本身来完成。2.抗终止作用抗终止作用（antitermination）是指RNA聚合酶阅读通过终止子，从而使转录过程不能在终止子处终止的一种机制，是细菌操纵子和噬菌体基因表达调控的一种方式。抗终止作用首先发现于λ噬菌体。λ噬菌体可以通过两种抗终止蛋白pN和pQ调控不同基因的表达。真核生物的转录和原核转录的不同点：(1)原核只有一种RNA聚合酶，而真核细胞有三种聚合酶；

(2)启动子的结构特点不同，真核有三种不同的启动子和有关的元件；

(3)真核的转录有很多蛋白质因子的介入。第五节转录产物的后加工多数转录的初始产物并无生物学活性，必须经过进一步的加工才有生物学活性，特别是对于真核生物转录产物的后加工更为重要。一、原核生物转录产物的后加工原核生物mRNA的寿命非常短，这是原核生物基因表达调控的一种手段。原核生物的mRNA不需要进一步的加工就可以具有生物学活性，作为翻译的模板。通过比较成熟的rRNA和tRNA与其原初转录产物，发现原核生物rRNA和tRNA的转录产物存在着后加工过程。参与蛋白质合成的tRNA和rRNA都不是最初的转录产物(1)它们的5′端都是单磷酸，而原始的转录产物5′应是三磷酸；(2)分子比初始转录物小；(3)tRNA含有特殊的碱基，这些碱基只有通过一些化学修饰才可以得到。1.rRNA的后加工原核生物有三种rRNA（5S、16S和23S），其基因（rDNA）与tRNA的基因（tDNA）混在一起，排列在一个操纵子（rrn）中。大肠杆菌有7个这样的操纵子。rrn操纵子有两个启动子，第一个启动子p1位于16SrRNA序列上游300bp左右，可能是主要的启动子；第二个启动子p2位于p1下游110bp左右，该操纵子转录的产物为