大连理工分析化学课件-第6章-紫外-可见分光光度法

主讲教师：宋文璟办公地点：C07-202第六章紫外-可见分光光度法主要内容

紫外-可见分光光度法的基本原理**紫外-可见分光光度计

显色反应及其光度测定条件的选择*

分光光度测量测定方法紫外-可见分光光度法的其他应用第一节紫外-可见分光光度法的基本原理概述基于物质光化学性质而建立起来的分析方法称之为光化学分析法。分为：光谱分析法和非光谱分析法。光谱分析法是指在光（或其他能量）的作用下，通过测量物质产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强度来进行分析的方法。吸收光谱分析发射光谱分析分子光谱分析原子光谱分析光波谱区、跃迁类型与对应的分析方法概述（续）在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸收光度法，主要有：红外吸收光谱（IR）：分子振动光谱，吸收光波长范围2.5～1000μm

，主要用于有机化合物结构鉴定。紫外吸收光谱（UV）：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200～400nm，可用于结构鉴定和定量分析。可见吸收光谱（Vis）：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400～750nm，主要用于有色物质的定量分析。光的基本性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波长λ、频率ν、光速c、波数σ（cm-1）等参数来描述：λ·ν=c；σ=1/λ=ν/c光是由光子流组成，光子的能量：E=h·ν=h·c/λ

（h是Planck常量）光的波长越短（频率越高），其能量越大。光的基本性质（续）白光（太阳光）：由各种单色光组成的复合光单色光：单波长的光（由具有相同能量的光子组成）可见光区：400～750nm*紫外光区：近紫外区200～400nm*

远紫外区10～200nm物质对光的选择性吸收及吸收曲线M+热M+荧光或磷光

E=E2

–

E1=h·

量子化；选择性吸收;分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；用不同波长的单色光照射，测吸收度—吸收曲线与最大吸收波长

max。M+h

M*基态激发态E1

（ΔE）E2物质颜色及其补色白光光的互补：蓝

黄吸收曲线的讨论同一种物质对不同波长的光的吸收度不同。吸收度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax。吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。吸收曲线的讨论（续）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸收度A有差异，在λmax处吸收度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。在λmax处吸收度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。透光率T透光率T：描述入射光透过溶液的程度T=It/I0**吸收度A与透光率T的关系:A

＝-lgT=-lg

(It/I0)=lg(I0/It)*****朗伯–比尔定律A＝κbc**A—吸收度，描述溶液对光的吸收程度；b—光程长度，通常以cm为单位；c—溶液的物质的量浓度，单位mol/L；κ为摩尔吸收系数，单位L/(mol·cm)。摩尔吸收系数κ在数值上等于浓度为1mol/L、光程长度为1cm时，该溶液在某一波长下的吸收度。***朗伯–比尔定律（续）A＝abρ**

ρ—溶液的质量浓度，单位g/L；a—质量吸收系数，单位L/(g·cm)。质量吸收系数a相当于浓度为1g/L、光程长度为1cm时该溶液在某一波长下的吸收度。分光光度法的灵敏度1、摩尔吸收系数κmax越大表明该物质的吸收能力越强，用分光光度法测定该物质的灵敏度越高。一般认为：κ>105

超高灵敏κ=(6～10）×104

高灵敏κ=(2～6）×104

中等灵敏κ<２×104

不灵敏摩尔吸收系数κ的讨论吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在波长等条件一定时，κ与待测物浓度无关；可作为定性鉴定的参数；同一吸收物质在不同波长下的κ值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸收系数，常以κmax表示。κmax表明了该吸收物质最大限度的吸收能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。分光光度法的灵敏度（续）2、质量吸收系数a与κ的关系为：a=κ/MM—物质的摩尔质量（g/mol）a便于定量地比较不同物质的灵敏度。因为对于不同待测组分，其摩尔质量往往不同，故不能简单地根据κ的大小来判断其灵敏度。分光光度法的灵敏度（续）3、桑德尔灵敏度S定义：当产生A=0.001的吸收度时，单位截面积(cm2)光程内所能检测出的吸收物质的最低含量，单位为μg/cm-2。一般分光光度计所能检测的最小吸收度A≈0.001。设A=0.001时所能检出某物质的最低浓度为ρmin（μg/mL)，ρminb总为定值，故定义桑德尔灵敏度S：S=ρminb分光光度法的灵敏度（续）3、桑德尔灵敏度S

λmax下的桑德尔灵敏度Smax，反映了分光光度法测定某物质所能达到的最大灵敏度。S与λ、a的关系：S=M/κS=1/a

*偏离朗伯–比尔定律的原因标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯–比尔定律的偏离。引起这种偏离的因素：1、物理性因素，即仪器的非理想化所引起的；2、化学性因素。*偏离朗伯–比尔定律的原因（续）物理性因素难以获得真正的纯单色光。朗伯–比尔定律的前提条件之一是入射光为单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯–比尔定律的正或负偏离。非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯–比尔定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。*偏离朗伯–比尔定律的原因（续）化学性因素朗伯–比尔定律的假定：所有的吸收质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液（c<10-2mol/L）时才基本符合。当溶液浓度c>10-2mol/L时，吸收质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。故：朗伯–比尔定律只适用于稀溶液。电子跃迁与吸收带类型分子的内能与能级分子内能级：电子能级Ee、振动能级Ev和转动能级Er：Ｅ＝Ee+Ev+Er

电子能级跃迁产生紫外-可见光谱，又称带状光谱。有机化合物分子内的电子跃迁（续）有机化合物的紫外-可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果（三种）：σ电子、π电子、n电子。分子轨道理论：一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道。通常外层电子均处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态（反键轨道）跃迁。四种主要跃迁所需能量ΔΕ大小顺序为n→π*<π→π*<n→σ*<σ→σ*有机化合物分子内的电子跃迁（续）σ→σ*跃迁所需能量最大，σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区（吸收波长λ<200nm，只能被真空紫外分光光度计检测到）。如甲烷的λmax为125nm、乙烷λmax为135nm。有机化合物分子内的电子跃迁（续）n→σ*跃迁所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。含非键电子的饱和烃衍生物（含N、O、S和卤素等杂原子）均呈现n→σ*跃迁。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n→σ*跃迁的λ分别为173nm、183nm和227nm。有机化合物分子内的电子跃迁（续）π→π*跃迁所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，摩尔吸收系数κmax一般在104L/(mol·cm)以上，属于强吸收。不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均可发生该类跃迁。如乙烯π→π*跃迁的λmax为162nm。有机化合物分子内的电子跃迁（续）n→π*跃迁需能量最低，吸收波长λ>200nm。这类跃迁在跃迁选律上属于禁阻跃迁，摩尔吸收系数一般为10～100L/(mol·cm)，吸收谱带强度较弱。分子中孤对电子和π键同时存在时发生n→π*跃迁。丙酮n→π*跃迁的λmax为275nm，κmax为22L/(mol·cm)（溶剂环己烷)。生色团与助色团生色团：最有用的紫外–可见光谱是由π→π*和n→π*跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。这类含有π键的不饱和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基－N＝N－、乙炔基、腈基－C≡N等。生色团与助色团（续）助色团：有一些含有n电子的基团(如-OH、-OR、-NH2、-NHR、-X等)，它们本身没有生色功能（不能吸收λ>200nm的光），但当它们与生色团相连时，就会发生n–π共轭作用，增强生色团的生色能力（吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加），这样的基团称为助色团。红移与蓝移有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化：λmax向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移（或紫移）。吸收强度即摩尔吸收系数κ增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应，如图所示。紫外-可见分子吸收光谱中的吸收带1、R吸收带：是由n–π共轭基团产生n→π*跃迁所形成的。特点：吸收强度较弱，κ<100L/(mol·cm)；最大吸收波长较长，λmax>270nm。R带随溶剂极性的增加而产生紫移，但若附近有强吸收带时则产生红移，有时甚至被掩盖。紫外-可见分子吸收光谱中的吸收带（续）2、K吸收带：是由共轭π键产生π→π*跃迁所形成的。特点：吸收强度高，κ>104L/(mol·cm)；最大吸收波长比R带短，217～280nm。如丁二烯的吸收峰λmax=217nm，κ=2.1×104L/(mol·cm)，即属K带。K带随共轭双键数目的增加，产生红移和增色效应。K带是共轭分子的特征吸收带，可用于推断有机物的共轭结构。紫外-可见分子吸收光谱中的吸收带（续）3、B吸收带：芳香族化合物的特征吸收带。特点：谱带上叠加有分子振动产生的精细结构，故常用来辨别芳香族化合物。在极性溶剂中或有取代基与苯环相连时，B带精细结构消失并产生红移；当苯环与生色团共轭时，则产生K和B两种吸收带，有时还会有R吸收带。波长顺序一般为R>B>K。紫外-可见分子吸收光谱中的吸收带（续）4、E吸收带：芳香族化合物的另一类特征吸收峰，苯环内π→π*跃迁所形成的。E带可分为E1带（λmax≈180nm）和E2带（λmax≈200nm），二者都是强吸收带，而B带相应是较弱的吸收带。最大吸收波长顺序为B>E2>E1，谱带强度顺序为E1>E2>B。当苯环上有助色团取代基时，E2带红移（λmax≈210nm）；当苯环与生色团共轭时，E2常与K带合并为K带，并产生显著红移。金属配合物的紫外-可见吸收光谱金属离子的电子跃迁摩尔吸收系数κ很小，对定量分析意义不大。金属离子与配位体反应生成配合物的颜色一般不同于游离金属离子（水合离子）和配位体本身的颜色。金属配合物的生色机理主要有三种类型：1、配位体微扰的金属离子d–d电子跃迁和f–f电子跃迁2、金属离子微扰的配位体内电子跃迁3、电荷转移吸收光谱电荷转移吸收光谱当吸收紫外可见辐射后，分子中原定域在金属M轨道上电荷的转移到配位体L的轨道，或按相反方向转移，这种跃迁称为电荷转移跃迁，所产生的吸收光谱称为荷移光谱。电荷转移跃迁本质上属于分子内氧化还原反应，因此呈现荷移光谱的必要条件是构成分子的二组分，一个为电子给予体，另一个应为电子接受体。电荷转移吸收光谱（续）电荷转移跃迁在跃迁选律上属于允许跃迁，其摩尔吸收系数一般都较大（约104），适宜于微量金属的检出和测定。电荷转移跃迁在紫外区或可见光呈现荷移光谱，荷移光谱的最大吸收波长及吸收强度与电荷转移的难易程度有关。例：Fe3+与SCN-形成血红色配合物，在490nm处有强吸收峰。其实质是发生了如下反应：[Fe3+SCN-]＋hν=[Fe2+SCN]2+

第二节紫外-可见分光光度计基本组成1、光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。光源单色器样品室检测器显示基本组成（续）2、单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任一波长单色光的光学系统。3、样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。色散元件是其核心部分，多采用棱镜或光栅。基本组成（续）4、检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5、结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理。分光光度计的类型第三节显色反应及其光度测定条件的选择显色反应的选择选择显色反应时应考虑的因素：灵敏度高、选择性高、生成物稳定、显色剂在测定波长处无明显吸收，两种有色物最大吸收波长之差（Δ

）称为对比度，要求Δ

>60nm。1、氧化还原显色反应某些元素的氧化态，如Mn(Ⅶ)、Cr(Ⅵ)在紫外或可见光区能强烈吸收，可利用氧化还原反应对待测离子进行显色后测定。显色反应的选择（续）例如：钢中微量锰的测定，Mn2+不能直接进行光度测定，将Mn2+

氧化成紫红色的MnO4+后，在525nm处进行测定。2Mn2++5S2O82-+8H2O=2MnO4++10SO42-+16H+2、配位显色反应当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生很强的紫外-可见吸收光谱。显色反应的选择（续）3、显色剂无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。有机显色剂：种类繁多，如偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成配合物后，颜色发生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等。显色反应条件的选择1、显色剂用量吸光度A与显色剂用量cR的关系会出现如图所示的几种情况，选择曲线变化平坦处。显色反应条件的选择（续）2、反应体系的酸度影响显色剂的解离平衡→显色反应的进行程度；金属离子形成羟基配合物乃至沉淀；影响显色配合物存在的形体，如Fe3+与磺基水杨酸的显色反应，pH2～3时，1:1配合

pH4～7时，1:2配合pH8～10时，1:3配合pH>12时，生成Fe(OH)3↓适宜的pH范围通过实验确定。显色反应条件的选择（续）3、显色时间与温度实验确定。4、溶剂一般尽量采用水相测定。5、共存离子干扰的消除加入掩蔽剂：选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。选择适当的显色反应条件，如pH值。分离干扰离子。光度测定条件的选择1、选择适当的入射波长一般应该选择λmax为入射光波长。如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。光度测定条件的选择（续）2、选择合适的参比溶液若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其他所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水）作参比溶液。若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用“试剂空白”（不加试样溶液）作参比溶液。光度测定条件的选择（续）若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用“试样空白”（不加显色剂）作参比溶液。若显色剂、试液中其他组分在测量波长处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。光度测定条件的选择（续）3、控制适宜的吸光度最佳读数范围：用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T=20%～65%，吸光度A=0.70～0.20**。浓度相对误差最小时的透光度Tmin为：Tmin＝36.8%,Amin＝0.434提高光度测定灵敏度和选择性的途径（了解）合成新的高灵敏度有机显色剂采用分离富集和测定相结合采用三元（多元）配合物显色体系第四节分光光度测量测定方法普通分光光度法1、单组分的测定通常采用A–c标准曲线法定量测定。2、多组分的同时测定若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组分测定没有区别。若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。普通分光光度法（续）Aλ1=κaλ1bca+κbλ1bcbAλ2=κbλ2bca+κbλ2bcb3、示差分光光度法普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差，需采用示差法，即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。普通分光光度法（续）设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs（cs<cx），则Ax=κbcx，As=κbcsΔA＝Ax-As=κb(cx-cs)=κbΔc

测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔA。示差法测得的吸光度与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx：cx=cs+Δc

示差法标尺扩展原理普通法：cs的T=10%；cx的T=5%示差法：cs做参比，调T=100%则：cx的T=50%，标尺扩展10倍。双波长分光光度法不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。ΔA＝Aλ2-Aλ1

＝(κλ2-κλ1)bc两波长处测得的吸光度差值ΔA与待测组分浓度成正比。κλ1和κλ2分别表示待测组分在λ1和λ2处的摩尔吸收系数。关键问题测量波长λ2和参比波长λ1的选择与组合以两组分x和y的双波长法测定为例：设：x为待测组分，y为干扰组分，二者的吸光度差分别为ΔAx和ΔAy，则该体系的总吸光度差ΔAx+y为：ΔAx+y=ΔAx+ΔAy选择波长λ1

、λ2有一定的要求。选择波长组合λ1、λ2的基本要求干扰组分在λ1和λ2处具有相同吸光度，即：故：此时，测得的吸光度差ΔA只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。待测组分在λ1