T-ZNZ 251-2024 淡水鱼及其养殖水体中嗜水气单胞菌的分离和药敏试验方法

ICS07.100.99CCSB41T/ZNZAntimicrobialsusceptibilitytestingforAeromonashydrophila浙江省农产品质量安全学会发布IT/ZNZ251—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。本文件起草单位：浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所、浙江省淡水水产研究所、湘湖实验室（农业浙江省实验室）、温州科技职业学院。本文件主要起草人：马剑钢、林锋、唐标、杨华、龙晓倩、吴静、郝贵杰、黄爱霞、周冬仁、王雨辰、韩青松。1T/ZNZ251—2024淡水鱼及其养殖水体中嗜水气单胞菌的分离和药敏试验方法本文件规定了淡水鱼及其养殖水体中嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila）的分离和药敏试验方法相关的术语和定义、设备、试剂和材料、试验程序、样品、分离培养、菌株确证、药敏试验及生物安全的要求。本文件适用于淡水鱼及其养殖水体中嗜水气单胞菌的分离和药敏试验。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB/T18652致病性嗜水气单胞菌检验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T28642饲料中沙门氏菌的快速检测方法聚合酶链式反应（PCR）法WS/T639抗菌药物敏感性试验的技术要求T/ZNZ044畜禽养殖环节细菌耐药性监测方法中华人民共和国农业农村部令第16号动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1药敏试验antimicrobialsusceptibilitytesting在体外测定微生物对抗菌药物敏感性的试验。3.2最低抑菌浓度minimalinhibitoryconcentration,MIC采用肉汤稀释法等对微生物进行药物敏感性检测试验，能抑制肉眼可见的细菌生长的最低抗菌药物浓度。3.3折点breakpoint2T/ZNZ251—2024用于区分菌株为敏感、中介和耐药的MIC值。4设备4.1超净工作台。4.2基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。4.3核酸电泳仪。4.4凝胶成像系统。4.5聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）扩增仪。4.6微量移液器：0.1μL～2.5μL、1μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL。4.7自动加样仪或多通道微量加样器：10μL～100μL。4.8电子天平：感量0.001g。4.9麦氏比浊仪：可测量范围0.01～4.00麦氏单位。4.10恒温培养箱：28℃±1℃,35℃±1℃。4.11低温运输箱：2℃~8℃。4.12冰箱：2℃~8℃,-20℃,-80℃。5试剂和材料5.1试剂5.1.1生理盐水：制备按附录A中A.1执行。5.1.2氨苄青霉素：纯度大于98%。5.1.3氨苄青霉素储液：按附录A中A.2执行。5.2培养基5.2.1氨苄青霉素麦康凯琼脂平板（McConkeyAgar）的制备按附录A中A.3执行。5.2.2RS琼脂平板（Rimler-ShottsAgar）的制备按附录A中A.4执行。5.2.3普通营养琼脂平板（NutrientAgar）的制备按附录A中A.5执行。5.2.4MH肉汤（Mueller-Hintonbroth）的制备按WS/T639执行。5.3参考菌株5.3.1阳性对照菌株嗜水气单胞菌标准菌株ATCC7966，保存、传代等应按照GB4789.28执行。5.3.2质控菌株大肠埃希菌（Escherichiacoli）标准菌株ATCC25922，保存、传代等应按照GB4789.28执行。5.4材料5.4.1无菌培养皿：直径60mm或90mm。5.4.2灭菌小试管：10mm×100mm。5.4.396孔透明无菌微孔板。5.4.4一次性无菌接种环：1μL和10μL。5.4.5无菌吸头：10μL、200μL和1mL。3T/ZNZ251—20245.4.6无菌水样采集袋、无菌采样管；5.4.7细菌DNA提取试剂盒。5.4.8PCR扩增试剂盒。5.4.9DNALadder。5.4.100.5×TAE电泳缓冲液。5.4.11标准比浊管。5.4.12商品化药敏试验板。6试验程序分离和药敏试验流程见图1。 采集淡水鱼粪便、组织及其环境水样接种氨苄青霉素麦康凯琼脂平板，28℃培养24h 可疑菌落接种RS琼脂平板，28℃培养24h～36h16SrDNA测序确证微生物质谱确证 菌种保藏 药敏试验结果报告图1嗜水气单胞菌的分离和药敏试验流程图7样品7.1采集7.1.1粪便在无菌条件下解剖取鱼肠道，刮取直肠末端粪便，放入无菌采样管中，标记信息，密封后2℃~8℃冷藏保存。7.1.2组织在无菌条件下采集鱼的病变部位（肌肉、肝、脾、肾、心等），放入无菌袋中，标记信息，密封后2℃~8℃冷藏保存，具体操作应按照GB/T18652执行。7.1.3水样用无菌水样采集袋收集50mL水样，标记信息，密封后2℃~8℃冷藏保存。4T/ZNZ251—20247.2运输样品按GB4789.1要求尽快运达检验单位，低温运输箱应保持清洁，运输过程中应防止包装破损导致样品渗漏。确认样品完好后尽快进行分离纯化。8分离培养8.1氨苄青霉素麦康凯琼脂平板培养用一次性无菌接种环蘸取粪便或组织脏器表面，划线于氨苄青霉素麦康凯琼脂平板上，28℃±1℃培养24h；将50mL水样在4℃下4000g/min离心5min，弃去上清，用一次性无菌接种环蘸取沉淀，划线于氨苄青霉素麦康凯琼脂平板上，28℃±1℃培养24h。边缘整齐、光滑、无色或淡黄色的圆形菌落为嗜水气单胞菌可疑菌落。8.2RS琼脂平板培养挑取可疑菌落，划线接种于RS琼脂平板上，28℃±1℃培养24h～36h。菌落初期呈黄色，24h以后呈蓝黑色的为嗜水气单胞菌可疑菌落。9菌株确证9.1PCR确证9.1.1细菌DNA提取将嗜水气单胞菌疑似菌落在普通营养琼脂上划线，35℃±1℃静置培养，挑取单菌落采用煮沸法或选用试剂盒提取细菌DNA，具体操作应按照GB/T28642的要求执行。9.1.2PCR扩增通过16SrDNA的引物进行PCR扩增，引物序列和反应条件按照附录B执行。9.1.3测序确证16SrDNA扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳观察，在1500bp位置观察到阳性条带，将产物测序后与嗜水气单胞菌的16SrDNA序列（AccessionNo.NR_074841.1）进行比对，序列一致即可确证为嗜水气单胞菌。9.2质谱确证有条件的实验室可通过MALDI-TOF-MS质谱仪对嗜水气单胞菌进行确证，具体操作应按照T/ZNZ044的要求执行。9.3菌株保存分离确证后的嗜水气单胞菌菌株保藏应按照GB4789.28执行。10药敏试验10.1试验板准备5T/ZNZ251—2024药敏试验板抗菌药物浓度范围按照附录C中C.1进行稀释，使用商品化药敏试验板时，应选择革兰氏阴性需氧菌药敏试验板，并按照药敏板说明书进行操作。10.2菌液制备待测菌株接种于普通营养琼脂平板上，35℃±1℃培养24h，连续培养2代，获得活化后的纯培养物。挑取3～4个单菌落转移至2mL无菌生理盐水中，用浊度仪测定并调整菌液浓度至0.5麦氏浊度(≈1×108CFU/mL用MH肉汤稀释100倍，混匀备用，制备的菌悬液应在15min内完成加样。每一批次药敏试验应设置质控菌株作为对照，质控菌株接种于普通营养琼脂平板上，35℃±1℃培养12h～18h，连续培养2代，按照相同方法处理制备质控菌悬液。10.3加样每块药敏试验板应设置阴性孔和阳性孔。阴性孔中加入无菌MH肉汤100μL，阳性孔（不含抗菌药物）中加入制备好的100μL菌悬液，其余孔（含不同梯度的抗菌药物）各加入制备菌悬液100μL，盖上无菌盖并标记菌株编号和时间等信息。10.4培养加样完成后置于35℃±1℃培养18h～20h。10.5MIC值判读和记录10.5.1取出药敏试验板，在光线良好条件下用肉眼观察结果。以肉眼可见抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。10.5.2如阴性孔未见浑浊且阳性孔浑浊，则该药敏试验板结果有效，可进行MIC结果的判读。10.5.3质控菌株判读结果在MIC质控范围内，则认为该次药敏试验有效。10.5.4在10.5.2和10.5.3同时有效的前提下，读取和记录每个菌的MIC值，若出现单个跳孔现象，可以忽略；出现两个以上跳孔现象的，则该次药敏试验无效，应重新检测。10.6药敏试验结果报告根据测试菌株的MIC值，按照附录C中C.2气单胞菌药敏试验标准判定其耐药性，结果报告为敏感（S）、中介（I）或耐药（R）。对于没有规定折点的药物，报告其MIC值。11生物安全11.1开展细菌分离与药敏试验等实验室管理应符合GB4789.1、GB19489生物安全要求。11.2废弃物处理应按照GB19489执行。11.3菌株管理按照中华人民共和国农业农村部令第16号文件中动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法相关规定执行。6T/ZNZ251—2024A.1生理盐水称取0.85g氯化钠（分析纯）溶于一定量的蒸馏水中，完全溶解后定容至100mL，121℃高压灭菌15min。A.2氨苄青霉素储液称取1.0g氨苄青霉素粉末，溶于10mL蒸馏水中，配置成100mg/mL的氨苄青霉素储液，用0.22μm滤膜过滤除菌。A.3氨苄青霉素麦康凯琼脂平板按照表A.1称取各组分，溶解于800mL蒸馏水中，调节pH至7.2，定容至1000mL,加入中性红0.03g和结晶紫0.001g，121℃高压灭菌15min。冷却至50℃~55℃,加入200μL氨苄青霉素储液，氨苄青霉素终浓度为20μg/mL，倾注无菌培养皿中。表A.1氨苄青霉素麦康凯琼脂平板成分A.4RS琼脂平板按照表A.2称取各组分，溶于800mL蒸馏水中，调节pH至7.0，定容至1000mL，煮沸1min，冷却至50℃~55℃,倾注无菌培养皿中。表A.2RS琼脂平板成分7T/ZNZ251—2024A.5普通营养琼脂平板按照表A.3称取各组分，溶解于800mL蒸馏水中，调节pH至7.3，定容至1000mL,121℃高压灭菌15min。冷却至50℃~55℃,倾注无菌培养皿中。表A.3普通营养琼脂平板成分8T/ZNZ251—2024PCR引物及条件B.1PCR引物嗜水气单胞菌16SrDNA引物序列见表B.1。表B.1嗜水气单胞菌PCR引物AGAGTTTGATCATGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTTB.2PCR反应条件B.2.1PCR程序94℃预变性5min；94℃变性20s；72℃延伸5min。B.2.2PCR反应体系PCR反应体系为30μL：15μL2×TaqPCRMix，1μL引物F（10μM），1μL引物R（10μM），12μLddH2O，每个体系含1μLDNA模板。9T/ZNZ251