复配型蛋白对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响

复配型蛋白对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响【摘要】本文以罗非鱼鱼糜为原料，探究谷氨酰胺转氨酶、小麦水解蛋白、大豆分离蛋白的添加量，对121℃处理鱼糜制品凝胶强度的影响，以单因素试验为基础，运用响应面分析法优化高温处理鱼糜制品制备的工艺配方。研究结果表明，当TG酶添加量为0.22%、小麦水解蛋白添加量为5.20%、大豆分离蛋白添加量为11.00%时，高温处理鱼糜制品的凝胶强度达到最大，此条件下其凝胶强度实际值为2164.25g·cm，与理论预测值基本一致，硬度为22.4283N，咀嚼性为0.2051N。【关键词】鱼糜；高温；凝胶强度；响应面分析法1.前言2020年我国水产品总产量高达6549万吨，生产的传统鱼糜制品在世界各地受到广泛欢迎，但鱼糜制品在国内外市场流通形式较为单一，主要通过冷藏、冷冻保存，且保存时间相对较短，需再次加热才可食用，较大程度上制约了鱼糜制品的发展。因此，高温杀菌即食鱼糜制品的研发，逐渐成为当前企业和科学院所关注的重点。将鱼糜制品经过121℃处理20min后进行真空保存，能够延长鱼糜制品货架期，实现常温流通，提升其食用的方便性。但当鱼糜经过121℃的高温处理后，蛋白质的三、四级结构会遭受较大破坏，蛋白质分子会因共价结合而产生聚集现象，肌球蛋白重链消失，造成鱼糜制品的凝胶结构劣化，导致产生凝胶强度显著下降的问题[1-4]。当前，关于改善高温处理鱼糜制品凝胶性能的研究，主要是通过添加一些蛋白类或者酶类来实现。如转谷氨酰胺酶（TG酶）是一种蛋白酶，它能催化鱼糜蛋白质分子形成ε-（γ-谷氨酸）-赖氨酸键，来加强蛋白质分子之间的共价交联作用，从而形成致密的凝胶网状结构，其作用特点是能将小分子蛋白质共价交联，形成更大的蛋白质分子[5-6]。此外，小麦水解蛋白在高温下可以形成很强的凝胶，因此在鱼糜中加入小麦水解蛋白，能够很好的改善鱼糜凝胶的质地，并使高温处理后的鱼糜制品凝胶热稳定性得到提升。这可能是由于其中的面筋蛋白均匀分散在肌原纤维蛋白中，形成网状结构，能阻止鱼糜肌原纤维蛋白分子在高温条件下聚集，抑制网状结构被破坏，从而能够提升鱼糜制品的凝胶强度[7-8]。还有，常见的大豆分离蛋白具有凝胶性，也有助于形成凝胶网络结构锁住水分、风味物质及其他食品成分，从而改善食品的品质。在加热过程中大豆蛋白分子变性后展开，形成纤维状聚集体，冷却过程中，在二硫键、氢键、疏水键等作用下，解离的蛋白质支链重新交联，形成富有粘弹性的凝胶[9]来填充鱼糜凝胶结构，从而达到提升鱼糜制品凝胶强度的目的。但是，当前国内外关于如何提高鱼糜制品在121℃处理下鱼糜凝胶热稳定性的研究还处于起步阶段，对凝胶性能的改善仍是一个挑战性难题。因此，本文以罗非鱼冷冻鱼糜主要原料，鱼糜凝胶强度为指标，通过添加TG酶、小麦水解蛋白、大豆分离蛋白，探究三者的不同添加量对121℃处理鱼糜制品凝胶强度的影响，以单因素试验为基础，运用响应面分析法优化高温处理鱼糜制品制备的工艺配方，以期为高温杀菌即食鱼糜制品的研发提供一定思路。2.原料与设备2.1原料表1试验原料清单表试验原料生产厂商罗非鱼冷冻鱼糜北海宏晖水产有限公司冻猪精膘福清胜田食品有限公司鸡胸肉湖南湘佳牧业股份有限公司小麦水解蛋白武汉科泰生化科技股份有限公司大豆分离蛋白福清胜田食品有限公司谷氨酰胺转氨酶（TG酶）泰兴市一鸣生物制品有限公司马铃薯淀粉河南恩苗食品有限公司食用盐莆田市晶秀轻化有限公司味精泉州中侨集团股份有限公司白砂糖惠万家食品有限公司塑料肠衣保定路德贸易有限公司2.2主要设备表2主要设备清单表主要设备生产厂商SIM-F140BDL型制冰机松下电器产业株式会社YH-C5001型电子天平昆山优科维特电子科技有限公司ZG-L74A型多功能绞肉机宁波赵记电器有限公司DK-S24型恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂EZtest-e2-s型食品物性分析仪厦门精艺兴业科技有限公司WSB-3C型白度计上海昕瑞仪器仪表有限公司DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司G21-SN216型恒温培养箱广东美的生活电器制造有限公司3.实验内容3.1工艺流程及制备工艺3.1.1工艺流程设计罗非鱼冷冻鱼糜、鸡胸肉→4℃下半解冻→冰水浴中空斩→盐斩→加入冻猪精膘→加入蛋白质（预先复配）→加入冰水、淀粉→→加盐、味精、白砂糖等调味料→斩拌至鱼浆表层光滑发亮→灌肠→置于40℃温水中（凝胶30min）→121℃处理20min→冷却至室温。3.1.2鱼肠制备工艺将罗非鱼冷冻鱼糜于4℃冰箱中半解冻12h，切成小块后置于冰水浴条件下的斩拌机中，加入鸡胸肉斩拌打散至混合均匀，继续加入食用盐搅拌，待其中的肌源纤维蛋白溶出而产生粘性后，加入肥猪精膘斩拌至鱼浆表层光滑发亮，依次加入蛋白质、冰水、淀粉，调味料，控制斩拌鱼糜的全过程温度在10℃以下[10]。将混合斩拌均匀后的鱼糜，使用手推式灌肠器灌入直径为30cm的塑料肠衣中，以麻绳封口后置于40℃恒温水浴锅中进行30min凝胶，之后置于立式压力蒸汽灭菌器中，于121℃下处理20min，冷却至室温，待测。3.2实验方法3.2.1单因素试验设计在前期预实验的基础上，确定121℃高温处理鱼肠制备的基础配方为：罗非鱼冷冻鱼糜100%；鸡胸肉15%；食用盐3.20%；肥膘20.00%；TG酶0.30%；小麦水解蛋白6.00%；大豆分离蛋白6.00%；淀粉16.00%；冰水33.00%；调味料3.40%。分别以TG酶、小麦水解蛋白、大豆分离蛋白、鸡胸肉的添加量为单一变量，进行单因素试验。在基础配方下，分别添加0.10%；0.20%；0.30%；0.40%；0.50%的TG酶，探究其对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响。在基础配方下，分别添加4.00%、6.00%；8.00%；10.00%；12.00%的小麦水解蛋白，探究其对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响。在基础配方下，分别添加4.00%、6.00%；8.00%；10.00%；12.00%的大豆分离蛋白，探究其对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响。在基础配方下，分别添加5.00%；10.00%；15.00%；20.00%；25.00%的鸡胸肉，探究其对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响。3.2.2响应面试验设计综合单因素实验结果，选取对鱼糜制品凝胶强度影响显著的3个因素，运用Design-Expert.V8.0.6.1软件，建立Box-Benhnken模型进行响应面试验设计，选取TG酶添加量、小麦水解蛋白添加量和大豆分离蛋白添加量三个影响较显著的因素为自变量，鱼糜制品凝胶强度为响应值，设计三因素三水平响应面试验方案，试验因素水平见表3。表3响应面试验因素水平表水平TG酶添加量(A)/%小麦蛋白添加量(B)/%大豆分离蛋白添加量(C)/%-10.15%5.00%9.00%00.20%6.00%10.00%-10.25%7.00%11.00%3.2.3凝胶强度测定将鱼肠切成厚度20mm的圆柱小段，选取切面光滑平整、无凹陷的小段鱼肠，置于食品物性分析仪的样品台上，选用直径1cm的柱状探头进行测试。设定测定条件为：食品检测模式，试验类型为压缩，测试速度20mm/min，下压距离10cm，压缩距离比为50%，测定高温处理鱼肠的破断力、破断距离[11]。在室温下每组平行测定3次，取3组的凝胶强度平均值为实验结果。凝胶强度计算公式为：凝胶强度/(g·cm)=破断力/g×破断距离/cm3.2.4微生物检验采用GB4789.2-2016的方法测定鱼糜制品的菌落总数，采用GB4789.3-2016的方法测定鱼糜制品的大肠菌群数。3.2.5白度测定采用WSB-3C型白度计测定鱼糜凝胶的L∗，a∗，b∗值，通过白度计算公式得到鱼糜肠的白度。白度计算公式为白度=100-[(100-L*)2+a∗2+b3.2.6水分含量测定采用GB5009.3-2016直接干燥法，测定鱼糜制品的水分含量。3.2.7数据统计分析每组鱼糜制品的凝胶强度取3次平行测定后的平均值，采用Origin2018软件作图，Design-Expert.V8.0.6.1软件进行响应面分析。4.结果与分析4.1单因素试验结果与分析4.1.1TG酶添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响在基础配方下，向鱼浆中分别添加0.10%；0.20%；0.30%；0.40%；0.50%的TG酶，探究TG酶添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响，结果如图1所示。图1TG酶添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响由图1可知，随着TG酶添加量的持续增加，高温处理鱼糜制品的凝胶强度先增大后逐渐下降。当TG酶添加量在0.10%-0.20%之间时，其凝胶强度随添加量增加而增强，这可能是由于外源TG酶的催化作用，使鱼肉蛋白质形成的ε-（γ-谷氨酸）-赖氨酸键增加，这增强了蛋白质分子内部的共价交联作用，从而改善高温处理鱼糜制品的凝胶性能，促进鱼糜凝胶网络结构的形成[13-15]。当TG酶添加量高于0.20%时，其凝胶强度随着TG酶添加量增加而持续减小，这是由于过量添加TG酶会导致鱼糜凝胶强度下降[16]。实验结果表明，当TG酶添加量为0.20%时，高温处理鱼糜制品的凝胶强度达到最大值1891.03g·cm，因此，选择TG酶添加量为0.15%、0.20%、0.25%进行响应面试验。4.1.2小麦水解蛋白添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响在基础配方下，向鱼浆中分别添加4.00%；6.00%；8.00%；10.00%；12.00%的小麦水解蛋白，探究小麦水解蛋白添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响，结果如图2所示。图2小麦水解蛋白添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响由图2可知，随着小麦水解蛋白添加量的持续增加，高温处理鱼糜制品的凝胶强度呈现先增大后下降再趋于平缓的趋势。当小麦水解蛋白添加量在4.00%-6.00%之间时，其凝胶强度随添加量增加而增强，这是因为小麦水解蛋白具有优良的胶黏和膨胀性能，当鱼糜的凝胶网状结构中均匀分布小麦水解蛋白时，在高温条件下产生的鱼糜肌原纤维蛋白分子聚集现象被阻止，抑制了鱼糜制品凝胶网状结构在高温下被破坏。当小麦水解蛋白添加量高于6.00%时，随着添加量的增加，鱼糜制品凝胶强度逐渐减小，减小至一定值后趋于平缓。这可能是因为由鱼糜蛋白减少引起的凝胶强度弱化作用强于小麦水解蛋白增强凝胶强度的作用[17]。实验结果表明，当小麦蛋白添加量为6.00%时，高温处理鱼糜制品的凝胶强度达到最大值1853.96g·cm，因此，选择小麦水解蛋白的添加量为5.00%、6.00%、7.00%进行响应面试验。4.1.3大豆分离蛋白添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响在基础配方下，向鱼浆中分别添加4.00%；6.00%；8.00%；10.00%；12.00%的大豆分离蛋白，探究大豆分离蛋白添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响，结果如图3所示。图3大豆分离蛋白添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响由图3可知，随着大豆分离蛋白添加量的持续增加，高温处理鱼糜制品的凝胶强度先持续增加后下降。当大豆分离蛋白添加量在4.00%-10.00%之间时，其凝胶强度随添加量的增加而增强，这是因为鱼浆中均匀混入大豆分离蛋白后，一方面可以抑制组织蛋白酶的活性，另一方面填充于鱼糜的凝胶网络结构中，通过自身凝胶作用提升鱼糜凝胶强度[18]。当大豆分离蛋白添加量高于10.00%时，随着添加量增加，其凝胶强度逐渐减小，这可能是由于大豆分离蛋白过量添加，从鱼糜凝胶中抢夺水分，造成产生蛋白浓缩效应[19]。实验结果表明，当大豆分离蛋白添加量为10.00%时，高温处理鱼糜制品的凝胶强度达到最大值2042.38g·cm，因此，选择大豆分离蛋白添加量为9.00%、10.00%、11.00%进行响应面试验。4.1.4鸡胸肉添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响在基础配方下，向鱼浆中分别添加5.00%；10.00%；15.00%；20.00%；25.00%的鸡胸肉，探究鸡胸肉添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响，结果如图4所示。图4鸡胸肉添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响由图4可知，随着鸡胸肉添加量的持续增加，高温处理鱼糜制品的凝胶强度总体变化不显著。这可能是由于鸡胸肉中疏水性氨基酸含量较高，肌原纤维蛋白在加工时逐渐变性展开，通过聚合作用形成大分子的凝胶体，能够提升疏水相互作用从而增大凝胶强度[20-21]，然而长时间的高温高压，导致鸡胸肉蛋白与鱼糜蛋白之间的疏水相互作用被破坏，使其无法提升鱼糜制品的凝胶强度。因此，鸡胸肉添加量对本实验中鱼糜制品的凝胶强度影响不显著。综上，固定基础配方中的鸡胸肉添加量为15%进行响应面试验。4.2响应面试验结果与分析4.2.1响应面试验设计与结果综合单因素试验结果，采用Design-Expert.V8.0.6.1软件设计高温处理鱼糜制品工艺优化响应面试验方案，以TG酶添加量(A)、小麦水解蛋白添加量(B)、大豆分离蛋白添加量(C)三个影响较显著的因素为自变量，鱼糜制品凝胶强度为响应值设计三因素三水平的响应面试验，试验方案与结果如表4所示。表4响应面试验设计与结果实验编号因素指标YABCTG酶添加量/%小麦蛋白添加量/%大豆分离蛋白添加量/%凝胶强度/（g·cm）10.155.0010.001882.3220.255.0010.002049.4630.157.0010.001796.7840.257.0010.001805.8550.156.009.001857.9560.256.009.001730.5970.156.0011.001859.9080.256.0011.002097.1990.205.009.001943.08100.207.009.001879.34110.205.0011.002136.94120.207.0011.001997.86130.206.0010.001894.15140.206.0010.001956.06150.206.0010.001930.62160.206.0010.001947.71170.206.0010.001889.564.2.2模型的建立及显著性分析运用Design-Expert.V8.0.6.1软件，对响应面试验结果进行多元回归分析，结果见表5。由表5的方差分析可知：该模型的P=0.0003<0.01，这表明该回归模型极显著，可以用来推测鱼糜制品的最优工艺配方；模型的总决定系数R2=0.9631，失拟项P=0.4603>0.05，这说明该模型的理论预测值与实际值相关性较高，此模型与本实验的拟合程度良好，得到的二次多项回归方程可信度高。三个因素对凝胶强度均有显著影响，影响的次序由大到小为：大豆分离蛋白添加量>小麦水解蛋白添加量>TG酶添加量。二次多项回归方程为：凝胶强度Y=1923.62+35.77A-66.50B+85.12C-39.52AB+91.16AC-18.83BC-71.46A^2+31.44B^2+34.25C^2。

表5方差分析表来源平方和自由度均方F值P值显著性模型1.736E+005919283.5420.300.0003**A-TG酶添加量10234.76110234.7610.780.0134*B-小麦水解蛋白添加量35373.18135373.1837.240.0005**C-大豆分离蛋白添加量57958.83157958.8361.020.0001**AB6246.5916246.596.580.0373*AC33243.42133243.4235.000.0006**BC1418.8711418.871.490.2612A221498.67121498.6722.640.0021**B24161.7814161.784.380.0746C24937.8214937.825.200.0566残差6648.537949.79失拟误差2938.163979.391.060.4603纯误差3710.374927.59总计1.802E+00516注：当P值<0.05时为显著，以“*”表示；当P值<0.01时为极显著，以“**”表示；当P值>0.05时为不显著。4.2.3响应面曲面与验证实验结果与分析图5TG酶和小麦水解蛋白的添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响图6TG酶和大豆分离蛋白的添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响 图7小麦水解蛋白和大豆分离蛋白的添加量对高温处理鱼糜制品凝胶强度的影响图5到图7为高温处理鱼糜制品响应面各因素交互作用的3D图与等高线图，3D图的曲面陡峭形态，反应的是各因素的相互作用对鱼糜制品凝胶强度的影响。实验结果表明，TG酶和大豆分离蛋白的添加量、TG酶与小麦水解蛋白的添加量对应的3D图曲面相对陡峭，说明其交互作用明显；而小麦水解蛋白与大豆分离蛋白的添加量对应的3D图曲线相对平缓，其交互作用对凝胶强度影响不大。这与表5的结论基本一致。采用Design-Expert.V8.0.6.1软件对鱼糜制品凝胶强度取最大值，得到高温处理鱼糜制品的最佳工艺配方为：TG酶添加量0.22%、小麦水解蛋白添加量5.20%、大豆分离蛋白添加量11.00%，此时最大凝胶强度理论预测值为2173.54g·cm。采用最佳工艺配方进行验证实验，实验结果取平均值，得到最佳凝胶强度实际值为2164.25g·cm，与预测值相近。验证实验结果表明，本次响应面优化试验得到的高温处理鱼糜制品凝胶强度结果较为可靠，可用于高温处理鱼糜制品制备工艺的研究分析，该鱼糜制品工艺配方具有实际应用意义。4.3微生物检验结果与分析由表6可知，鱼糜制品经过121℃处理20min后菌落总数与大肠菌群数的实验测定值均为0，这是由于长时间高温高压破坏细菌内部组织结构从而达到灭菌的目的。因此，经过121℃处理20min的鱼糜制品可获得较长的保质期，大大增加了其食用、贮藏、流通的方便性。表6微生物指标测定结果表项目实验测定值国家标准菌落总数/（CFU/g）0≤3000大肠杆菌/（MPN/100g）0≤304.4质构特性与其他指标结果与分析根据响应面分析法优化得到的工艺配方制备鱼肠，多组平行测定鱼肠的质构特性、白度及水分含量，结果见表7。测定结果表明，鱼糜制品的质构特性中弹性有所提升，可能是由于鸡胸肉中含有大量肌肉蛋白从而增大鱼糜制品的剪切力，达到改善鱼糜制品弹性的效果，而硬度和咀嚼性显著下降，这可能是高温处理破坏了鱼糜制品的凝胶网络结构所导致的。相比于传统鱼肠，121℃处理鱼糜制品的白度大幅下降，呈现微黄色，其原因是小麦水解蛋白、大豆分离蛋白本身为微黄色，加入至鱼糜制品经熟化后会降低产品的白度。两者的水分含量相差较小，这是可能由于本实验在制备121℃处理鱼糜制品时采用塑料肠衣灌肠并进行封口处理，有效防止了水分的蒸发。

表7鱼糜制品质构特性与其他指标测定结果表产品弹性（N/mm^2）硬度（N）咀嚼性（N）白度值（wb）水分含量（%）高温处理鱼肠0.610922.42830.205137.7254.70传统鱼肠0.503733.08640.645655.9852.135.工厂设计5.1工艺流程图根据高温处理鱼糜制品的工艺流程和设备需求，结合工厂规模化生产鱼肠的实际要求设计高温处理鱼肠加工工艺流程图，见附录A。5.2核心设备图制备高温处理鱼糜制品的关键工艺在于121℃下杀菌20min，以达到长期保存、方便食用的目的。因此，该工艺的核心设备为反压式高温杀菌釜，其三视图见附录B。6.结论通过单因素实验和响应面分析法优化，确定TG酶添加量、小麦水解蛋白添加量、大豆分离蛋白添加量三个因素对高温处理鱼糜制品凝胶强度影响的次序为：大豆分离蛋白添加量＞小麦水解蛋白添加量＞TG酶添加量，得到高温处理鱼糜制品的最佳工艺配方为：罗非鱼冷冻鱼糜100%；鸡胸肉15%；食用盐3.20%；肥膘20.00%；TG酶0.22%；小麦水解蛋白5.20%；大豆分离蛋白11.00%；淀粉16.00%；冰水33.00%；调味料3.40%。在此条件下，制得的鱼糜制品凝胶强度实际值为2164.25g·cm，与理论预测值2173.54g·cm基本一致，此时的鱼糜制品表面光滑细腻，呈微黄色，具有较好的弹性和硬度。本实验研发了一种高温处理鱼糜制品工艺配方，有利于推动鱼糜制品的常温贮藏，延长其货架期，为即食型鱼糜制品的研发提供了一定思路。参考文献于楠楠，李景敏，汤楚琦，等.羊血浆蛋白对高温杀菌鱼糜制品凝胶特性的影响[J].食品工业科技，2020，41(16)：32-36+42.[1]ShashiK.Pankaj，ZifanWan，KevinM.Keener.EffectsofColdPlasmaonFoodQuality:AReview[J].Foods，2018，7(1)：4.韩静文.鱼糜凝胶热加工特性及耐热型鱼糜肠配方研究[D].江苏：江南大学，2018.宋恭帅，陈康，俞喜娜，等.热杀菌对即食鲟鱼鱼糜制品品质的影响[J].食品与发酵工业，2019，45(24)：153-160+167.于楠楠，王卫东，陈学红，等.TG酶对高温杀菌鱼糜凝胶特性影响[J].食品工业，2020，41(04)：98-101.马玉婵，马良，张宇昊.高温杀菌后鱼糜制品的劣变及改进[J].农业工程，2016，6(06)：37-42+45.李钰金，林洪，赵元晖，等.蛋白质类添加物在鱼糜制品中的应用现状及发展趋势[J].食品研究与开发，2020，41(05)：220-224.张莉莉.高温（100~120℃）处理对鱼糜及其复合凝胶热稳定性的影响[D].山东：中国海洋大学，2013.周建中，张晖.植物蛋白凝胶及其应用研究进展[J].食品与生物技术学报，2013，32(11)：1128-1135.常莉莉，崔浩哲，张志慧，等.海水鱼丸加工工艺及外源添加剂对高温杀菌后鱼丸品质保持研究[J].食品工业科技，2020，41(23)：195-202.施源德，杨琴，黄迪惠，等.酶促交联罗非鱼肉重组工艺研究[J].食品工业科技，2018，39(10)：64-