DB61-T+1815-2024化妆品修护功效测试技术规范

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DB61陕 西 省 地 方 标 准DB61/T1815—2024化妆品修护功效测试技术规范TechnicalSpecificationforcosmeticsrepairefficacytest20242024040320240503陕西省市场监督管理局发布DB61/T1815DB61/T1815—2024DB61/T1815DB61/T1815—2024目  次前言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1基本要求 2测试准备 3测试 3数据分析 4测试报告 5质量保证 5附录A（资料性）图片处理方法 6II前  言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由陕西省药品监督管理局提出并归口。本文件起草单位：陕西省食品药品检验研究院、陕西博溪通用检测科技有限公司、陕西省药品和疫苗检查中心、陕西省药品技术审评中心、咸阳市食品药品检验检测中心。本文件主要起草人：蔡虎、刘海静、冯润东、曹涵博、杨文娟、吴小勇、党琳琳、卢永波、李潇、王莉芳、罗阿利、张若冰、李晓春。本文件首次发布。本文件由陕西省食品药品检验研究院负责解释。联系信息如下：单位：陕西省食品药品检验研究院电话编：710065II地址：陕西省西安市高新区科技五路21邮编：710065II化妆品修护功效测试技术规范范围本文件适用于化妆品体外角质形成细胞迁移率的测试。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T622 化学试剂盐酸GB/T646 化学试剂氯化钾GB/T678 化学试剂乙醇(无水乙醇)GB/T1266 GB/T1274 GB/T1266 GB/T1274 化学试剂磷酸二氢钾GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T21395 二甲基亚砜SN/T3899 化妆品体外替代试验良好细胞培养和样品制备规范3术语和定义SN/T3899界定的以及下列术语及定义适用于本文件。3.1修护repair有助于维护施用部位保持正常状态。3.2细胞迁移cellmigration指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的刺激后而产生的移动。3.3细胞铺板率cellfusionrate细胞覆盖培养皿的面积占培养皿总表面积的百分比。1基本要求环境要求100级要求，环境温度应控制在20℃～24℃，环境湿度应控制在50%～70%，防震动，防电磁干扰。其他试验操作应在常规实验室环境下进行，生物安全等级达到一级要求。耗材和试剂一般要求所用试剂应为分析纯，试验用水应按GB/T6682的要求进行制备。与细胞培养相关试剂、耗材应作无菌处理。耗材耗材应满足下列要求：25cm2、75cm2；6孔平底细胞培养板；1.5mL、15mL、50mL；0.22μm；直尺长度≥15cm。试剂试剂应满足下列要求：GB/T213950.22μm；直尺长度≥15cm。试剂试剂应满足下列要求：GB/T21395的要求；GB/T678的要求；磷酸二氢钾（KH2PO4）GB/T12745的要求；十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）GB/T12635的要求；氯化钠（NaCl）GB/T12665的要求；氯化钾（KClGB/T6465的要求；盐酸（HCl）GB/T6225的要求；角质形成细胞培养基为无血清培养基；表皮细胞生长因子(EGF)纯度≥95。试剂配制试剂配制应满足以下要求：（0.10.27g2.87g8.00g0.20g800mLpH7.41000mL，过14d；EGF溶液（1ng/mL）10ngEGF10mL1ng/mL28d。仪器设备2仪器设备应符合以下要求：100倍～400倍；37℃，5CO2，95%相对湿度；0.0001g；100μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL；100级。测试准备细胞准备应采用人源皮肤的原代角质形成细胞，以角质形成细胞培养基为基础培养液于细胞培养箱中培养。P72×105个细胞/6324h±2h用于试验。2条线，两2.0cm。样品制备受试物的配制应根据受试物理化特性选择合适的溶剂配置成受试物工作液，配制要求如下：（母液中受试物的浓度应为试验浓10倍～1000倍），过滤除菌，然后使用细胞培养液稀释到试验浓度；（母100倍～1000倍），过滤除菌，其中二甲基亚砜或无水乙1%。受试物浓度的选择应通过细胞毒性试验确定受试物安全浓度范围，以受试物处理细胞后细胞活力≥90%时的浓度为安全浓度的最高浓度，在安全浓度范围内，选择1个～3个浓度作为受试物试验浓度。实验分组试验过程中应按以下要求分组：空白对照组：使用角质形成细胞培养基培养细胞；1ng/mLEGF；受试物组：使用含有一定浓度的受试物的角质形成细胞培养基培养细胞。测试受试物孵育3应弃掉培养孔中的细胞培养液，更换新的培养液，操作过程按照5.3要求进行，各组细胞孵育时间宜为24h±2h。划痕每孔细胞铺板率应达到90%～100%2（如图1所示1mL磷酸盐缓冲溶液进行拍照观察。16孔板划痕示意图一次拍照43张照片，记录初始划痕面积。换液拍照结束应弃掉磷酸盐缓冲溶液，每孔更换为角质形成细胞培养液，细胞培养箱中孵育拍照结束应弃掉磷酸盐缓冲溶液，每孔更换为角质形成细胞培养液，细胞培养箱中孵育24h±2h。6.5二次拍照孵育结束按照6.3要求记录24h划痕面积。7数据分析图片处理24h划痕面积，图片处理方法见附录A。数据计算每组应取3个复孔的平均值作为检测结果，结果表示为平均值±标准差（Mean±SD）。计算公式见式（1）：Migrationrate(S0hS24h)/S0h100% (1)式中：Migrationrate——迁移率（%）；S0h——0h划痕面积（cm2）；S24h——24h划痕面积（cm2）。统计分析4数据应使用t检验、双尾检验分析显著性差异。与空白对照组相比，p<0.05则认为其具有统计学差异。7.4精密度试验中每组3（Coefficientof应≤20%见式（2：(SD/Mean)100% (2)式中：C.V——变异系数(%)；SD——Mean——迁移率的平均值。8测试报告宜包括但不限于以下几个方面的内容：——目的；——材料；——设备；——方法；——数据与统计分析；——结果。——方法；——数据与统计分析；——结果。9质量保证24h70～80%。90%～100。与空白对照组相比，阳性对照组的迁移率提升且具有统计学差异（p<0.05）。5附录A（资料性）以ImageJ图像分析软件为例，进行图片处理方法的说明。图片统一化处理划痕面积计算使用ImageJ软件进行划痕面积的计算。导入要计算的图片，执行以下命令：Image-Type-8-bit黑白化处理；Process-Smooth画面平滑；Process-Findedges增强边缘显示；Process-Filters-