《植物次生代谢产物有机酸的测定》

GB/TXXXXX—XXXX

植物次生代谢产物有机酸的测定

1范围

本标准规定了植物次生代谢产物有机酸的液相色谱-质谱/质谱测定方法。

本标准适用于蔬菜、水果、中药材、茶叶、烟草等样品中酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、

柠檬酸、富马酸、琥珀酸、乌头酸、α-酮戊二酸、己二酸、没食子酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香

酸、对香豆酸酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸和3,4-二羟基苯甲酸的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

试样用50%甲醇水溶液加热回流提取后，经反相色谱柱分离，液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，

内标法定量。

4试剂或材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

4.1甲醇：色谱纯。

4.2甲酸：色谱纯。

4.30.1%甲酸水溶液：准确移取甲酸1.0mL于1L容量瓶中，用水定容至刻度。

4.450%甲醇水溶液：准确移取甲醇500.0mL于1L容量瓶中，用水定容至刻度。

4.5有机酸标准品：没食子酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、酒石酸、奎

宁酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸、乌头酸、己二酸、α-酮戊二酸、对羟基苯

甲酸、肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸和琥珀酸-2,2,3,3-d4，纯度均≥98%。

4.6混合标准储备液A（酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸、乌头

酸、α-酮戊二酸、没食子酸混合标准储备溶液）：分别准确称取各有机酸标准品50.00mg于10mL容

量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀，配制成5000.0mg/L的有机酸单一标准储备液，分别吸取适量

各有机酸单一标准储备液于10mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，混匀，配制成100mg/L的混合

标准储备液A，于0℃～4℃保存，有效期为3个月。

1

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4.7混合标准储备液B（己二酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸酸、阿魏酸、对羟基

苯甲酸、肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸混合标准储备溶液）：分别准确称取各有机酸

标准品50.00mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀，配制成5000mg/L的有机酸单

一标准储备液，分别吸取适量各有机酸单一标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，

混匀，配制成100mg/L的混合标准储备液B，于0℃～4℃保存，有效期为3个月。

4.8内标储备液：准确称取琥珀酸-2,2,3,3-d410.00mg于100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并

定容至刻度，混匀，配制成浓度为100mg/L的内标储备液。

4.9内标稀释液Ⅰ：准确吸取内标储备液2.5mL于1L容量瓶中，用50%甲醇水溶液稀释并定容至刻

度，混匀，即得浓度为250µg/L内标稀释液Ⅰ溶液。

4.10内标稀释液Ⅱ：准确吸取内标储备液1.0mL于100mL容量瓶中，加50%甲醇水溶液稀释并定

容至刻度，混匀，即得浓度为1mg/L内标稀释液Ⅱ溶液。

4.11混合系列标准工作溶液：分别准确移取不同体积混合标准储备液A和混合标准储备溶液B于10

mL容量瓶中，再准确加入2.5mL内标稀释液Ⅱ，用50%甲醇水溶液稀释配制成不同浓度的系列标准

工作溶液，现配现用。

4.120.22μm微孔尼龙滤膜。

5仪器设备

5.1液相色谱-质谱/质谱联用仪：配有电喷雾离子源（ESI）。

5.2电子天平:感量为0.0001g和0.01mg。

5.3高速离心机：转速不低于9500r/min。

5.4水果搅拌机。

5.5高速粉碎机。

5.6旋转蒸发仪。

6分析步骤

6.1样品制备

将蔬菜、水果等新鲜样品用水果搅拌机制成匀浆，制备好的试样均分为两份，装入洁净的盛样容器

内，密封并标明记号，于-18℃冷冻保存。

中药材、茶叶、烟草等干制样品研磨成细粉，样品全部过425µm的标准网筛，混匀，制备好的试

样均分为两份，装入洁净的盛样容器内，密封并标明记号。

6.2试样处理

6.2.1干样前处理

准确称取约1.5g（精确至0.001g）试样于250mL圆底烧瓶中，精密加入50mL内标稀释液Ⅰ，

称定重量，加热回流2.5h，冷却至室温后用50%甲醇水溶液补足失重，混匀，取5mL提取液于10000

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r/min下离心5min，取上层清液适量过0.22μm尼龙滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

6.2.2鲜样前处理

准确称取约10g（精确至0.001g）试样于250mL圆底烧瓶中，加入5mL甲醇于40℃水浴减压浓

缩至1mL左右，精密加入50mL内标稀释液Ⅰ，称定重量，加热回流0.5h，冷却至室温后用50%甲

醇水溶液补足失重，混匀，取5mL提取液于10000r/min下离心5min，取上层清液适量过0.22μm尼

龙滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

6.3仪器参考条件

6.3.1液相色谱条件

a)色谱柱：ACQUITYUPLCHSST3柱，2.1mm×100mm，3μm，或同等性能的色谱柱。

b)流动相：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序见表1：

c)流速：0.2mL/min。

d)柱温：35℃。

e)进样量：1μL。

表1梯度洗脱条件

时间/min流动相体积分数A/%流动相体积分数B/%

0955

6955

154060

20595

25595

25.1955

35955

6.3.2质谱条件

f)离子源：电喷雾离子源（ESI源）；

g)扫描方式：负离子模式；

h)检测方式：多重反应监测（MRM）；

i)干燥气、雾化气、碰撞气均为高纯氮气（纯度≥99.998%）；使用前应调节各气体流量以使质

谱灵敏度达到检测要求，详细条件参加附录B。

j)喷雾电压、碎裂电压、碰撞能量等参数应优化至最优灵敏度，参考条件见附录B中表B.1。

6.4液相色谱-质谱/质谱测定

6.4.1定性测定

在相同的实验条件下，样品溶液中被测物的色谱峰保留时间和标准工作溶液的一致（变化范围在±

2.5%以内），并且在扣除背景后的样品溶液谱图中，所选择的离子对均出现，而且所选择的离子对丰度

比和标准品离子对的相对丰度比偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。

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表2定性离子对相对丰度的最大允许偏差

相对离子丰度/%＞50＞20～50＞10～20≤10

允许的相对偏差/%±20±25±30±50

6.4.2定量测定

在仪器最佳工作条件下，将有机酸系列混合标准工作溶液依次进样分析，以被测物和内标物的定量

离子对峰面积为纵坐标，以被测物和内标物的浓度比为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样

品进行定量，应使样品溶液中各被测物的响应值在仪器测定的线性范围内，如果含量超过标准工作曲线

范围，应稀释到合适浓度后分析。在上述色谱条件下，22种有机酸混合标准工作溶液的多重反应监测色

谱图见图1。

图1混合有机酸标准工作液多重反应监测（MRM）色谱图

6.5平行试验

按以上步骤对同一试样进行平行试验测定。

7结果分析

试样中有机酸的含量按下式计算：

cv

X=

m........................................(2)

式中：

X----试样中被测组分含量，单位为豪克每千克（mg/kg）；

C----从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

V----试样溶液体积，单位为毫升（mL）；

m----试样的质量，单位为克(g)。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。

8精密度

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在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

9其他

本方法测定23种有机酸的定量限见附录A中表A.1。

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AA

附录A

（资料性附录）

有机酸信息及定量限

表A.1有机酸信息及定量限

定量限（mg/kg）

序号中文名称英文名称CAS号分子式分子量

干样鲜样

1酒石酸tartaricacid133-37-9C4H6O6150.091.330.20

2奎宁酸quinicacid77-95-2C7H12O6192.171.330.20

3苹果酸malicacid636-61-3C4H6O5134.090.330.05

4莽草酸shikimicacid138-59-0C7H10O5174.161.330.20

5乳酸lacticacid50-21-5C3H6O390.085.000.75

6a-酮戊二酸2-ketoglutaricacid328-50-7C5H6O5146.101.330.20

7柠檬酸citricAcid5949-29-1C6H8O7·.H2O210.142.670.40

8富马酸fumaricacid110-17-8C4H4O4116.071.330.20

9琥珀酸succinicAcid110-15-6C4H6O4118.090.330.05

10乌头酸aconiticacid4023-65-8C6H6O6174.11166.725.0

11没食子酸gallicacid5995-86-8C7H6O5·.H2O188.130.330.05

3,4-dihydroxybenzoic

123,4-二羟基苯甲酸99-50-3C7H6O4154.120.33

acid0.05

13己二酸adipicacid124-04-9C6H10O4146.140.660.10

p-hydroxybenzoic

14对羟基苯甲酸99-96-7C7H6O3138.120.33

acid0.05

2,5-dihydroxybenzoic

152,5-二羟基苯甲酸490-79-9C7H5O4154.120.33

acid0.05

16绿原酸chlorogenicacid327-97-9C16H18O9354.310.330.05

17咖啡酸caffeicacid331-39-5C9H8O4180.160.660.10

18香草酸vanillicacid121-34-6C8H8O4168.151.330.20

19丁香酸syringicacid530-57-4C9H10O5198.171.330.20

20对香豆酸p-coumaricacid501-98-4C9H8O3164.160.330.05

21阿魏酸ferulicacid1135-24-6C10H10O4194.180.660.10

22肉桂酸cinnamicacid140-10-3C9H8O2148.1610.001.50

Butanedioic

23琥珀酸-2,2,3,3-d414493-42-6C4H2D4O4122.11//

acid-2,2,3,3-d4

B

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CB

附录B

（资料性附录）

液相色谱-质谱/质谱参数参考条件1）

参考质谱条件如下：

a）扫描方式：负离子模式；

b）检测方式：多重反应监测（MRM）；

c）干燥气（N2）温度：290℃；

d）雾化气（N2）压力：30psi；

e）干燥气流速：7.0L/min；

f）鞘气温度：350℃；

g）鞘气流速：12.0L/min；

h）喷雾电压：3500V；

i）定性离子对、定量离子对、碰撞能量、碎裂电压见表B.1。

表B.122种有机酸的MRM质谱分析参数

序号中文名称保留时间（min）定量离子对定性离子对源内碎裂电压（V）碰撞能（V）

1酒石酸2.739149.0/87.1149.0/87.1；149.0/73.0755；10

2奎宁酸2.724191.1/85.1191.1/85.1；191.1/93.011017；17

3苹果酸3.402132.9/115.0132.9/115.0；132.9/71.1701；7

4莽草酸3.454173.1/93.0173.1/93.0；173.1/137.06512；2

5乳酸4.11289.1/43.089.1/43.0；89.1/45.1652；2

6a-酮戊二酸3.939145.0/101.1145.0/101.1；145.0/57.1601；1

7柠檬酸5.492191.1/111.0191.1/111.0；191.1/87.0753；9

8富马酸6.823114.9/71.1114.9/71.1；114.9/32.1501；5

9琥珀酸6.531116.9/73.1116.9/73.1；116.9/99.0653；1

10乌头酸6.099173.0/85.1173.0/85.1；173.0/128.9553；1

11没食子酸10.638169.0/125.0169.0/125.0；169.0/124.0957；21

123,4-二羟基苯甲酸17.024153.0/109.1153.0/109.1；153.0/108.0957；19

13己二酸15.521145.1/101.2145.1/101.2；145.1/83.2753；3

14对羟基苯甲酸16.934137.0/93.0137.0/93.0；137.0/65.0807；27

152,5-二羟基苯甲酸14.886153.0/109.0153.0/109.0；153.0/108.0805；17

16绿原酸16.551353.0/191.0353.0/191.0；353.0/85.011510；45

17咖啡酸17.539179.0/135.1179.0/135.1；179.0/134.0907；21

18香草酸17.519167.0/152.0167.0/152.0；167.0/108.01005；12

19丁香酸17.766197.0/182.0197.0/182.0；197.0/123.0855；17

20对香豆酸18.902163.0/119.0163.0/119.0；163.0/93.1807；31

21阿魏酸19.075193.1/134.0193.1/134.0；193.1/178.08510；5

22肉桂酸21.582147.0/103.0147.0/103.0；147.0/77.1552；17

23琥珀酸-2,2,3,3-d46.396121.0/77.0121.0/77.0；147.0/102.07510：10

1）非商业性声明：附录A所列参数是在Agilent6465质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参

考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。

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7

ICS07.080

点击此处添加中国标准文献分类号

中华人民共和国国家标准

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植物次生代谢产物有机酸的测定

Determinationoforganicacidsofplantsecondarymetabolites

点击此处添加与国际标准一致性程度的标识

（征求意见稿）

（本稿完成日期：2019年02月10日）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

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植物次生代谢产物有机酸的测定

1范围

本标准规定了植物次生代谢产物有机酸的液相色谱-质谱/质谱测定方法。

本标准适用于蔬菜、水果、中药材、茶叶、烟草等样品中酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、

柠檬酸、富马酸、琥珀酸、乌头酸、α-酮戊二酸、己二酸、没食子酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香

酸、对香豆酸酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸和3,4-二羟基苯甲酸的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

试样用50%甲醇水溶液加热回流提取后，经反相色谱柱分离，液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，

内标法定量。

4试剂或材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

4.1甲醇：色谱纯。

4.2甲酸：色谱纯。

4.30.1%甲酸水溶液：准确移取甲酸1.0mL于1L容量瓶中，用水定容至刻度。

4.450%甲醇水溶液：准确移取甲醇500.0mL于1L容量瓶中，用水定容至刻度。

4.5有机酸标准品：没食子酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、酒石酸、奎

宁酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸、乌头酸、己二酸、α-酮戊二酸、对羟基苯

甲酸、肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸和琥珀酸-2,2,3,3-d4，纯度均≥98%。

4.6混合标准储备液A（酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸、乌头

酸、α-酮戊二酸、没食子酸混合标准储备溶液）：分别准确称取各有机酸标准品50.00mg于10mL容

量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀，配制成5000.0mg/L的有机酸单一标准储备液，分别吸取适量

各有机酸单一标准储备液于10mL容量瓶中，用水稀释并定容至