第三篇食品中各类微生物检验

的检验和致病性微生物的检验等。中的小曲酒和黄酒生产中的淋饭酒在某种程度上就是由甜酒酿发展而来的。的淀粉糖化，将蛋白质水解成氨基酸，然后酒药中的酵母菌利用糖化产物生长繁殖，并通过酵解途径将糖转化成酒精，从而赋予甜酒酿特有的香气、风味和丰富的营养。随着发酵时间延长，甜酒酿中的糖分逐渐转化成酒精，因而糖度下降，酒度提高，故适时结束发酵是保持甜酒酿口味的关键。原料选择→洗米蒸饭→淋水降温→落缸搭窝→接种→保温发酵→后熟成凹形圆窝，面上洒少许酒药粉。盖上培养皿盖。天左右即可。酸奶因具有清新爽口的味觉而倍受欢迎,又由于酸乳中会有乳酸菌它对肠道内的致病菌有一定的丑掣作用,故对人体的肠道消化道疾病有良好的治疗效果。酸乳是以牛乳为主要原料，接入一定量的乳酸菌，经发酵后而制成的一种乳制品饮料,凝集，这种凝乳状酸奶称为凝固型酸奶。恒温培养箱、冰箱、不锈钢锅。在添加生产发酵剂后立即进行包装,并在包装容器中发酵而成,成品呈凝乳状。↓原料鲜奶一→净化一→脂肪含量标准化一→配料一→过滤一→预热一→均-→冷却-→接种一→分装一→发酵一→冷却一→后熟。（1）牛奶瓶消毒：将牛奶瓶在不锈钢锅里用沸水煮15分钟。（2）牛乳的净化：利用特别设计的离心机,除去牛乳中的白血球和其他肉眼口见的异物。（3）脂肪含量标准化：鲜奶中脂肪含量比较高,为了避免酸奶中有脂肪析出,因此需要对鲜奶的脂肪含量进行离机,从牛乳中分离出稀奶油,然后在得到的脱脂乳中再掺入一定量稀奶油,使调制乳的脂肪含量达到要求。a.奶粉的添加:经脂肪含量标准化处理的调制乳(或按1：7的比例加水把奶粉配制成复原牛奶)，为了使其非脂干物质含量达到要求,一般往调制乳中添加脱脂奶粉,经如此处理的酸奶有一定的硬度,脱脂奶粉的添加量一般为1%-3%。糖,如果蔗糖量加入过多,会因调制乳渗透压的增加而阻碍乳酸菌主长一般是先将原料乳加（5）均质：用于制作酸奶的原料乳一般都要进行均质处理,经过均质处理,乳脂肪被充分分散酸奶不会发生脂肪上浮现象,酸奶的硬度和粘度都有所提高,而且酸奶口感细腻,更易被消化吸收,将加热和均质两种方法适当结合起来,处理的效果会更好,一般是先将原料乳地垫至60℃左右,然后在均质机中,于8-1OMpa压力对乳进行均质处理。（6）灭菌：点：℃除去原料乳中的氧及由于乳清蛋白的变性而增加的-SH,从而使氧化还原电位下降,助长乳酸菌的生长。网状结构中分离出来。℃灭菌后,使乳中原本存在的酶失活,使发酵过程成为单一乳酸菌的作用过程,易于控制生产。（7）接种：(13)品味：时,发酵所需时间并不因种量加大而缩短,而酸奶的风味由于发酵前期酸度上升太快反而变差,所以,任意加大接种量是无益的,反之,若接种量过小,发酵所需时间延长,酸奶的酸味会显得不够。（8）分装：酸奶受到振动,凝乳状态易被破坏,因此,不能在发酵罐中先发酵然后再进行。分装,必须是将会有乳酸菌的牛乳培养基先分装到销售用的玻璃瓶或塑料小容器中,加盖后送入恒温室容器上部留出的空隙要尽可能小,这样容器中的内容晃动幅度小,酸奶的形态易保持完整,另温度与所设定的发酵温度接近,整个发酵时间就不会被延长。（9）发酵:将装有含乳酸菌的牛乳的容器置于恒温箱中进行发酵,恒温箱的温度保持在40-43℃,时b.发酵奶的流动性变差,基本凝固。发酵结束,在将酸奶移放进冷藏室进行贮存和后熟处理之前,应将酸奶从发酵室中取出,℃牛乳凝固时会产生收缩力,导致乳清折出,在低温时这种收缩力比较弱,所以乳清不易从酸奶中分离出来；酸奶应有凝块,质地细腻,酸甜适中,清新爽口,若有不良异味,则很可能是酸奶污染了杂菌。在发酵罐中接种生产发酵剂,凝固后,再经搅拌入杯成其它容器中,产品凝乳粒子直径保持在0.01-0.04mm大小。呈半流动状态的粥糊状,易使用吸管吸食。原料鲜奶→配料→预热→均质→杀菌→冷却→接种→搅拌→发酵→冷却→搅拌混合→装瓶→冷却→后发酵↑将凝固型酸奶均质处理后,使凝乳充分分散,凝乳粒子直径在0.01mm以下的酸奶,这种酸奶的特点是与牛乳相似,呈液体状。凝固型酸奶→混合→均质→分装→冷却→冷藏↑为了防止饮料型酸奶产生分层现象,一般在疑固型酸奶中加入稳定剂,然后再用均质机破□人工合成稳定剂,如海藻酸丙二醇酶(PGA)等；□天然稳定剂,如明胶、琼脂、海藻酸纳和果胶等。稳定剂的种类、添加量和添加方式,对于制备凝固塑酸到十分重要。将LM果胶用水溶解,经灭菌后冷却到接近酸奶的温度(20-15□),然后加入酸奶中搅匀。在1OMPa压力下,将上述酸奶进行均质处理。均质后的酸乳液,灌装到销售用的小容器中后,迅速冷却到10□以下。果汁酸奶是在凝固型酸奶中添加果汁和稳定剂后，再经均质处理制成的。低酸味凝固型酸奶→混合→均质→分装→冷却→冷藏↑果汁(露)的添加会增加酸奶的酸味,因此在接种时,将嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌两者的比例改变成10:1,目的是减少保加利亚乳杆菌产生的乳酸,这样可避免产生酸味过强,制备低酸味凝固型酸奶的其它操作步骤,与一般凝固型酸奶的制法相同。溶液,搅拌均匀。将经均质处理过的果汁酸奶乳液灌装到销售用的小容器中,迅速将其冷却到10□由牛乳制成酸奶后,用加热方法将酸奶中所有微生物杀灭的一种酸奶,此种酸奶特点是:不存在乳酸菌和其它微生物,保存期中酸奶酸度不会改变,且保存期延长,但凝乳经加热后,十分容易折出乳清,需在发酵前加稳定剂,灭菌后酸奶的营养价值也有所降低。杀菌型酸奶除多了一步杀菌工序外,其它操作步骤与凝固型酸奶基本相同。酸奶中的微生物杀死制作杀菌型酸奶常使用这种方法。其它步骤(略)。在酸奶中添加糖和香料,按照冰淇淋生产工艺加工成保健饮料。按冷冻酸奶是否含有活菌,可将其划分为活菌型冷冻酸奶和杀菌型冷冻酸奶两种↑(1)牛乳的净化、脂肪含量标准化和配料的操作方法与制作凝固型酸奶相同。固型冷冻酸奶,也可以将成熟后的酸奶不经过冷冻硬化,在分装后直接冷藏保存制成搅拌型冷冻酸奶。(1)选择优质、新鲜的牛奶和酸奶(作为菌种)。(2)严格无菌操作,尽量避免杂菌污染。a.来源于健康牛所产的乳,色泽呈乳白色或微黄色,气味芳香、无异味初乳、末乳、细菌污染乳均不得使用。b.乳牛注射抗生素后所产出乳,四天内不得使用。生产前应做小样。d.原料中不得含碱及菌剂等杂质。e.奶温不高于10□,70度酒精试验无絮状物沉淀。乳清折出。深受消费者喜爱。酵母加入面粉和水的混和合物中后,在28□左右的温度下,利用面粉中含有少量单糖与蔗糖开始生长繁殖,在生长繁殖的同时,面粉中的β-淀粉酶能将面粉中的淀粉转化为麦芽糖。2(C6H1005)+2nH20────→n(C12H麦芽糖的增加,为酵母菌进一步生长发酵提供了可利用的营养物质。酵母菌菌体本身能够分泌麦芽糖酶和蔗糖酶,将麦芽糖和蔗糖分解成单糖,供酵母菌利用。(C12H22011)+H20────→C6H120醛和一些有机酸等产物。C6H1206+6O2────→6CO2+6H20+C6H1206────→C2H5OH+2CO2生成的二氧化碳由于被面团中的面筋包围,不易跑出,留在面团内,从而使面团逐渐胖大。膨胀,逸散,从而使面包充满多孔,形成海绵状。在发酵中形成的其它物质如乙醇、乳酸、醋酸、醛酮类等有机化合物,在烘烤中形成了面包特有的香味。钢刀、瓷盘、远红外电热烤箱。2-4小时。将剩余的原辅料拌入经过第一次发酵的面团中搅拌均匀后在28-30□下发酵1.5-2小时。将发酵好的面团,按要求切成小块加工成各种形状,注意应搓得均匀飞紧密，不要使表面有裂纹。将面包坯放入烤箱中,在约200□温度下烘烤8-10分钟。面包出炉后,温度很高,须经冷却后才能包装和贮藏。面包的表面应为金黄色或棕黄色,色泽均匀一致,富有光泽,无烤焦或发自现象,内部颜色洁白。组织气孔细密均匀,富有弹性。香味纯正,有面包特有香味。种和质量的依据。稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可获得满意的结果。MRS培养基，改良CHALMERS培养基，M17培养基。无菌移液管（25ml,1ml无菌水（225ml带玻璃珠三角瓶，9ml试管无菌培养皿，旋涡均匀器。恒温培养箱。中，在旋涡均匀器上充分振摇，务必使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将样品稀释至适当的稀释度。CHALMERS培养基倒平皿，迅速转动平皿使之混合均匀，冷却成平板。将平皿倒置于40□恒温箱内培养24~48h，观察长出的细小菌落，计菌落数目，按常规方法选择30~300个菌落平皿进行计算。乳酸菌的菌落很小，1~3mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。由于产酸菌落周围能使CaCO3产生溶解圈，酸碱指示剂呈酸性显色反应。状，成单杆、或双杆菌或长丝状。嗜热链球菌，呈球状，成对、或短链、或长链状。球菌的培养，在检测时可同时使用多个培养基作比较。本篇主要包括食品中菌落总数、大肠菌群、各种致病菌、霉菌和寄生虫的检括食品中菌落总数和大肠菌群的测定，这两个项目是每一种出厂食品都必须检测的项目。食品中菌落总数的测定，目的在于了解食品在生产中，从原料加工到成品包被检样品进行卫生学评价时提供依据。食品有可能被多种类群的微生物所污染，每种细菌都有它一定的生理特性，不同的营养条件及其生理条件(如温度、培养时间、PH值、需氧性质等)去满足其要求，才得1g或lmL检样中所合细菌菌落的总数。食品中菌落总数的多少，直接反映着食品的卫生质鱼贝冰蛋从表中可以看出食品的变质反映与菌落总数的增多有一定联系，但有时食品管理的状况。从食品卫生观点来看，食品中菌落总数越多，说明食品质量越差，也就应考来评定食品卫生质量的优劣。还有一些食品，如酸泡菜、发酵乳等发酵制品，也不能单凭测定菌落总生质量，因为发酵制品本身就是通过微生物的作用而制成的。根据以上事实，食品中菌落总数的测定对评定食品的新鲜度和卫生质量卫生指标作用，但还必须配合大肠菌群的检验和病原菌项目的检验，才能作出比较全面准确评定。品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。%酒精棉球、玻璃蜡笔、登记薄□以无菌操作，将检样25g(或25mL)剪碎以后，放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预先置适当数量的玻固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器□另取1mL的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，□根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在度作两个平皿。□稀释液移入平皿后，应及时将凉至46□营养琼脂培养基[可放置在(45土1)□水浴锅内保温]注入平皿15mI一20mL，并转动平皿位混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。□待琼脂凝固后，翻转平板，置(36土1)□恒温箱内培养(48土2)h取出板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得Ig(1mL)样品所含菌落总数。做成几个适当倍数的稀释液选择2~3个适宜稀释度各以1mL之量分别加入灭菌平皿每皿内加入46□适量营养琼脂选取菌落数在30一300之间的平板作为菌落总数测定标准。一布2fB均匀，可计算半个平板后乘2U代表整个平皿菌落数。□若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30一300之间，则视二者之比如何来决定。菌落数在100以刚t1按其实有数字后面的数字，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的示，见表5-2“报告方式”一栏。两稀释12345560007□平板培养计数法，只能检出生长的活菌，不能捡出样品中全部的细菌数，总是比实际前一般食品的卫生检验中都普遍采用这种方法。□平板菌落计数测定食品中的菌落总数，一般均采用中温培养，特别是已属于直接供食菌污染，这些病原菌都属于嗜温性菌，因而测定细菌数时，采用中温培养是比较合理的。上节标准平板培养汁数法虽是国家制定的菌落总数测定方法，在一定程度上能反映食高温、中温和低温之分，所需的pH值和营养条件也不尽相同，并且和培养时间也有关系。培养温度/□（48±3）h指一群在37□、24h能发酵乳糖，产大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。靛基质红酸44.5□大肠艾希氏菌□++————+/-+大肠艾希氏菌□+————+/-—大肠艾希氏菌□++————+/-—费劳地拘橼酸杆菌□—+—++/-—+/-—费劳地拘橼酸杆菌□++ ++/- +/- 产气克雷伯氏菌□——+—————产气克雷伯氏菌□+—++————+—++——+/-—注：+，表示阳性；ℴ,表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和□型的特点是，对靛基质、甲基红、肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯便污染的指标菌。品，也是不卫生的，不受人喜欢的。作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。□存在于肠道内持有的细菌，才能显示出指标的特异性。□在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出。□在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不再繁殖。□检验方法简便，易于检出和计数。在食品卫生微生物检验中，可作为粪便污染指标菌依据的上述条件，粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似，指标菌是比较适宜的。道内第二个较大的菌群；厌气性乳酸菌占人体肠道内细菌组分的50％以上，一般粪便中该为，在冷踪食品或冷冻状态照射处理过的食品中，大肠杆菌可比其他多种病原菌容易死亡，为这类食品的粪便污染指标菌就比较适宜。上述的这些肠道内的其他细菌，虽与粪便有关，细菌。当然，大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些□饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行。□大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。□在外界环境中，有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主所以具有广泛的卫生学意义。由于大肠菌群作为粪便污染指标菌而被列入食品卫生微生物学常规检验项目，如果食限量的食品，即可确定其卫生学上是不合格的，该食品食用是不安全的。大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。能性。食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（themostprobablenumber简称MPN）表示。乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。产气肠杆菌（Enterobacteriaae单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。□以无菌操作将校样25g(或25mL)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌□根据食品卫生要求或对检验样品污染情况的估计按种3管。也可直接用样品接种。即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。1mL及1mL以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置(36土1)□培养箱内，培养(24土2)h，的所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大则按下列程序进行。如有产生者，则按下列程序进行。，：即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酪管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体。在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1—发酵管，置(36士l)□的温箱内培养(24土2)h，观察产气情况。伊红美蓝琼脂平板伊红美蓝琼脂平板凡乳糖发酵管产气．革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。大肠菌群的最可能数。000000000123010000111123020021022023030031032033100101102103110111112113120121122123130131132133222200000123222211110123222222220123230222333123300301302303310311312313320321322323330331332333大肠菌群最可能数检索表中数值，系通过几率计算出来的。由于我国在大肠菌群检验的情况。Nλ=2.303×lgA/B（1）N——检出大肠菌群的乳糖发酵管所加样品量；A——加进所有各管组乳糖发酵管内样品的总量；B——所有各管组未检出大肠菌群管中样品的总量。λ=0.23个／mI2.两组乳糖发酵管内有大肠菌群存在时，用公式中N1P——管组□每管内加N1mL(g)样品量，有P个大肠菌群阳性管；N2γ——管组□每管内加N2mL(g)样品量，有γ个大肠菌群阳性管；γ——大肠菌群的员可能数(个／mL或个／g)；A——加进所有各管组乳糖发酵管内样品的总量；B——所有各管组未检出大肠菌群管中样品的总量。值与计算出的λ值相符(或最接近时)时，则所假定的λ值，即为大肠菌群的最可能数。因此，N1=1N1P=3N2=0.1N2γ=0.2A=33.3令K=10-4343N2λ,则lgK=-0.4343N2λ将以上各值代入公式(2)得：=2.303×0.0679963=0.1565955样品接种量较例3低10倍，故大扬菌N1λ=2.303×[B(AN1PN3t)×100.4343N2λ(AN1PN2Y)×100.4343N3λ+(AN1P)×100.4343(N2+N3)λ][B(AN1PN3t)×100.4343N2λ(AN1PN2Y)×100.4343N3λ+(AN1P)×100.4343(N2+N3)λ]式中A——加进所有各管组乳糖发酵管内样品的总量；B——所有各管内未检出大肠菌群管中样品的总邑，N1P——管组□每管加入N1mL(g)样品，有P个大肠菌群阳性管；N2γ——管组□每管加入N2mL(g)样品，有γ个大肠菌群阳性管；N3t——管组□每管加入N3mL(g)样品，有t个大肠菌群阳性管；λ——大肠菌群的最可能数，个／mL或个／g。应用公式(3)时，与应用公式(2)相同，也须先假定λ值，用计算法代入公式内以计算出λ值，当代进公式的假定值与计算出的λ值相符(或最的最可能数。□□□333231因此，N1=10N1P=20N2=1N2γ=3N3t=0.1A=33.3□□令K14343N2λ,则lgK1=0.4343N2λ令K=10一4343N2λ,则lgK2=一0.4343N3λ□□令K3=10—4343(N2+N3)λ,则lgK3=—0.4343(N2+N3)λ□设λ=0.36个／mL，代入□□□式可得；=-0.0156348=-0.171982810λ=2.303×所以，λ=0.363045l7λ三0.36由计算结果的λ值与所假设的λ值相符，因此大肠菌群员可能数为0.36个／mL(g)所以肠菌群最可能数为360个。coliform)系指一群能在44□24h内发酵乳糖产酸产气和利用色氨酸产生靛基质，需氧和兼性粪大肠菌群的唯一来源是粪便，因此，唯有粪大肠菌群是粪便污染的确切指标。在被数称为总大肠菌群数者。近年来，曾有人建议采用大肠菌群和粪大肠菌群两种细菌作为食品卫生学的指标菌，作出恰当的判定。同大肠菌群。将检样以无菌操作接种于乳糖胆盐发酵管内(1mL以上者1mL及管都不产气，则可报告为阴性；如果有产气者，则按下列程序进行。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长，粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂平板上菌落呈紫黑色，有金属光泽，同时做革兰氏染色镜检。在蛋白陈水内加入靛基质试剂约凡靛基质阳性，平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。能数。究，并取得了一定成绩。1985年5月在西宁召开了大肠菌群快速检验方法会议，总结了近年来我国大肠菌群快速检验方面的经验，通过24个单位1099件样品(包括乳与乳制品、冷饮、肉制品、豆制品、调味品、啤酒、糕点等)的统计分析，可以认为当前国内应用的三种快速检验方法(TTC显色法、DC试管法和纸片法)的准确性和符合率均较高，与发酵法结果八、思考题：食品中病原菌的检验主要包括食品原料及食品中各种病原菌的检验，如金黄色葡萄球种病原菌。在此只介绍大肠希氏菌的检验。正常情况下，大肠艾希氏菌不致病，而且还能合成维生素B和K，生产大肠菌素，对因，人的带菌亦可污染食品，引起中毒。产不耐热肠毒素（LT）和产耐热肠毒素（ST）大肠艾希氏菌标准菌株、食品检样。多粘菌素B纸片；0.1％硫椰汞溶液；2％伊文思蓝溶液；革兰氏染色液。Honda氏产毒肉汤；E1ek氏培养基；氧化酶试剂。天平；均质器或乳钵；温箱(36土1)□、42□;水浴：显微镜；离心机；酶标仪；细菌玻片；酒精灯；灭菌金属匙或玻璃棒；接种棒、镍铬丝；)接种棒、镍铬丝；试管架、试管篓；冰箱；注射器；灭菌的刀子、剪子、镊子；硝酸纤维素滤膜。样品采集后应尽快检验。以无菌操作称取检样25g，加在225mL营养肉汤中，以均质 菌肉场内，于42□培养18h。将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；落。这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素、琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36□培养过夜。氏菌。必要时做氧化酶试验或革兰氏染色镜检。□假定试验凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。即为假定试验阳性。□证实实验做试管凝集试验。混匀后放于50□水浴箱内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该O抗原。□产毒培养将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6mLCAYE培养基内，37□振荡培养过□LT检测方法(双抗体夹心法)苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，于4□冰箱湿盒中过夜。去尽孔中残留液体。封闭：每孔加100μL封闭液，于37□水浴中lh。洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。加样本：每孔分别加多种试验菌株产毒培养液100μl，37□洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。加酶标抗体：先在酶标LT抗体管中加0.5ml稀释液，混匀后全部吸出于3.6ml稀释液洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度0D值，待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桶黄色或明显高于阴性对照为阳性。□ST检测方法(抗原竞争法)一孔留空作对照，置4□冰箱湿盒中过夜。洗板：用洗涤液I洗3次，操作同上。封闭：每孔加100μl封闭液，37□水浴比。洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。抗体50μl(先在ST单克隆抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于1.6ml稀释液中，洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。加酶标记兔抗鼠1g复合物：先在酶标记免抗鼠1g复合物管中加0.5mL稀释液，混匀洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值；目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中央和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。余体重之比大于0.09为阳性，0.07—0.09为可疑。成分：制法：7.2-7.4，加入琼脂，加热煮沸使琼脂溶化，分注:此培养基可供一般细菌培养之用，可倾注平板或制成斜面。如用于菌落计数，琼脂量为1.5如作成平板或斜面，则应为2％。成分：猪胆盐(或牛、羊胆盐)5gpH7.4制法：个小倒管，115□高压灭菌15min。注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。成分：pH7.4制法：注：□双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。□30mL和l0mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用，3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。成分：猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g0.5%中性红水溶液5mL制法：□将蛋白胨、朊胨、胆盐和氧化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正600mL蒸馏水中，加热溶解，将两液合并，分装于烧瓶内，121□高压灭菌15min备用。□临用时加热熔化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50□一55液，摇匀后倾注平板。结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。成分：制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，121□高压灭菌摇匀，倾注平扳。成分：pH7.4制法：高的底层。l21□高压灭菌15min，放置高层斜上层培并基成分：血消化汤(pH7.6)50下层培养基成分：血消化汤(pH7.6)50□取血消化汤按上层和下层的琼脂用量，分别加入琼脂，加热溶解。□分别加入其他各种成分。将上层培养基分装于烧瓶内；将下层培养茬分装于灭菌□将上层培养基放在56□水浴箱内保温；将下层培养基直立放在室温内．使其凝固。□待下层培养基凝固后，以无菌操作将上层培养基分装于下层培养基的上面，每管约成分：pH7.5制法：按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH7.4-7.6注：供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异等试验用。