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DB41DB41/T1588—2018饲料中沙门氏菌的检测EMA-PCR法2018-04-17发布2018-07-17实施河南省质量技术监督局发布I1）：4.42×PremixTaq缓冲液：内含TaqDNA聚合酶1.25a）上游引物：5＇-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG-3';4.11叠氮溴化乙锭（EMA，0.2mg/mL见附录A的A.5。4.12溴化乙锭（10mg/mL）。4.13灭菌离心管：1.5mL，15mL。25.4离心机：转速≥12000r/min。取25g试样于225mL缓冲蛋白胨水（4.2）中，充分混匀，36℃±1℃培养18h±2h进行预增菌，取0.1mL预增菌液转移至10mL氯化镁-孔雀绿增菌液（4.3）中，42℃±1℃培养24h±2h。如果试样量不取1mL增菌液至离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。加入1mL灭菌水悬浮沉淀物，离心管开盖置于冰上，卤素灯照射下曝光2min，然后水浴煮沸10min，再将离心管转移至冰浴中使其称取1.5g琼脂糖（4.6）加入100mL1×TAE电泳缓冲左右，加入5μL溴化乙锭（4.12），充分混匀，根据需要在模板内放入合适的梳子，倒入凝胶3与1μL6×上样缓冲液（4.10）混合后加入到上样孔内，设Mar恒压下电泳20min～30min。如果沙门氏菌阳性对照的PCR产物在284bp处出现条带（参见附录B），同时阴性对照PCR产物于284bp处未出现条带，则检测结果成立；样品的PCR产物电泳后在284bp处出现条带，则为疑似阳性样品，此时需按GB/T13091进行确证，样品的PCR产物电泳后在284bp处未出现条带，判定25g样品中未检出沙门氏菌。4培养基和试剂A.1.1成分10.0g5.0g9.0g水1000mLA.1.2制法A.2.1.1成分蛋白胨5.0g氯化钠8.0g磷酸二氢钾1.6g水1000mLA.2.1.2制法A.2.2.1成分2O）400g水1000mLA.2.2.2制法A.2.3.1成分5孔雀绿0.4gA.2.3.2制法A.2.4完全培养基A.2.4.1成分溶液A1000mL溶液B100mLA.2.4.2制法按上述比例配制，调节至pH5.2，分装每管10mL。115℃高压灭菌15min。A.3.1成分242.0g37.2g57.1mL942.9mLA.3.2制法调节至pH8.3，定容至1L后，室温保存。使用时稀释50倍即为A.4.1成分0.5g0.5g0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0）0.06mL360mL640mLA.4.2制法0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶于500mL灭菌水中，加入溴酚蓝和二甲苯氰FF溶解，与甘油混合，定容至1000mL，分装后4℃保存。6A.5.1成分叠氮溴化乙锭5mg灭菌水25mL

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