三特异性抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展

ChineseBulletinofLifeSciences(厦门大学公共卫生学院，国家传染病诊断试抗原结合位点的创新疗法。与单克隆抗体和双特异性抗体相比，三特异性抗体可增加结合特异性，降低脱靶毒性，在肿瘤免疫治疗领域具有广阔的应用前景。本文主要介绍了三特异性抗体的发展进程、主要构建形式及其作用机制，总结了不同靶点组合的代表性药物的最新研究进展，并讨论了其存在的挑战和未来发ResearchprogressoftrispecificantibodiXULin,NINGWen-Jing,LIUXue,LUOWen-Xin*(NationalInstituteofDiagnosticsandVaccineDevelopmentinInfectionsDiseases,SchoolofPublicHeAbstract:Trispecificantumorcellsorimmuneeffectorcellssimultaneously.Comparedwithmonoclonalantibodiesandbispecificinthefieldoftumorimmunotherapy.Inthispaper,weintroducethedevelopmentprocessandmechanismofactionofTsAbs.Furthermore,wesummarizethelatestresearchprogressonrepresentativedrugswithdifferenttargetcombinations.Finally,wediscusaimingtoprovidenewideasforthedevelopmentoftrispecificantibodydrugs.Keywords:trispecificantibodies;cancerimmunotherapy;CD3因其特异性强、靶向性高和毒副作用小等特点，被广泛应用于治疗各类重大疾病，包括肿瘤、感染性疾病、自身性免疫疾病等，成为药物研发市场的主力军。在肿瘤治疗领域，由于免疫抑制性微环境及肿瘤免疫逃逸机制的复杂性，这种针对单一靶点的药物往往难以达到理想的治疗效果，临床上表现为响应率不高，获益群体比较有限。因此，双特异性抗体(bispecificantibodies,BsAbs)药物应运而生，为治疗提供了新途径。与单克隆抗体相比，双特异性抗体具有双重功能和高度特异性，被视为抗体工程领域的“二代抗体”[1]。双特异性抗体能与两种抗原表位特异性结合或桥接并激活免疫细胞[2]，达到两药联合治疗的效果。其中研究较多的是T细共有8款T细胞接合器被FDA批准上市。尽管单克隆抗体和双特异性抗体在临床治疗上都发挥了至关重要的作用，但对于恶性肿瘤的治疗疗效仍然有限[1]，因而开发一种新的治疗策略对增强反应活性基金项目：国家自然科学基金项目(32070940)；博士434生命科学和缓解耐药性都具有一定的临床价值。随着抗体药物的发展，同时靶向三个特异性抗原结合位点的三特异性抗体(trispecificantibodies,TsAbs)在肿瘤治疗领域展现了非凡的应用前景。TsAbs是一种潜在也可通过招募免疫细胞进行肿瘤重定向，从而增强抗肿瘤免疫。与双特异性抗体相比，三特异性抗体还能够与肿瘤细胞或免疫细胞表面的另一个靶点相结合，或桥接免疫细胞并阻断双信号通路等作用，更有利于将药物或免疫细胞重定向至肿瘤部位，增强结合特异性，提高靶向性，降低脱靶毒性[3]，从而提升抗肿瘤能力(表1)。本文将介绍三特异性抗体的发展进程，总结不同靶点组合的代表性药物的最新研究进展，以期为下一代三特异性抗体药物的1991年，德国慕尼黑大学首次提出靶向TAA是T细胞接合器TCE的早期概念设计。1999年，RobertF.Graziano开发了一种三特异并在细胞水平上进行了功能验证[5]，但此时三特异性抗体的具体生物学功能尚未得到深入研究。步入学研究所构建了一种名为CEA(cancerembryonic活T细胞杀死癌细胞外，TsAbs还被设计用于桥接NK细胞和肿瘤细胞，增强NK细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)功能，从而更有效地杀死肿瘤细胞。同时期，许多靶向CD16的TsAbs已经开始被报道，如CD16/CD123/CD33、CD16/CD19/CD22[7]。越来越多的学者开始深入研究不同靶点组合、结构形式、作用机制下三特异性抗体如何杀伤肿瘤细胞而发挥药物疗效，2015年后TsAbs目前，全球尚无三特异性抗体药物获批上市，不过已有多家生物医药企业布局三特异性抗体，并国内成都恩沐生物、博锐生物、嘉和生物等企业亦走在前沿的是辉瑞公司开发的一款Anti-IL-13/IL-4/TSLP(PF-07275315)，属于三功能融合蛋白，针对特应性皮炎(atopicdermatitis,AD)，目前已进入临床2期。2020年，哈普恩治疗公司(Harpoon328)的三特异性抗体，针对小细胞肺癌(SCLC)的赛诺菲公司(Sanofi)开发了一款Anti-CD3/CD38/CD28(SAR442257)的三特异性抗体，其介导了强烈的肿瘤细胞杀伤作用，与抗CD38单抗相比，SAR442257在体外对CD38高表达和CD38低表达的多发性骨髓瘤细胞(multiplemyeloma,MM)均表现出高3~4个数量级的杀伤效力[1]。该药物针对复发难治性MM和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma,NHL)的临床研究，目前处于临床1期(NCT04401020)。2021年，赛诺菲与Innate公司合NK细胞接合器(SAR443579)，目前处于临床1/2期(NCT05086315)，有可能成为血液系统恶性肿瘤患者的新选择。此外，赛诺菲还布局了Anti-CD3/CD28/HER2(SAR443216)和Anti-NKp46/Numab公司(NumabTherapeutics)研发的靶向PD-L1/4-1BB/HSA(PD-L1：programmedcelldeath1serumalbumin，人血清白蛋白)的三特异性抗体NM21-1480正在实体瘤中进行临床1/2期验证(NCT04442126)。普米斯生物技术公司(Biotheus)研发的靶向PD-L1/TGF-β/VEGF的三特异性抗体PM8003也在晚期实体瘤中开展临床1/2期研究2三特异性抗体的构建形式及作用机制三特异性抗体按照作用机制的不同主要分为：T细胞接合器、免疫检查点抑制剂、NK细胞接合TAA)、延长半衰期的TCE以及三功能融合蛋白等。T细胞接合器(TCE)是肿瘤免疫治疗中用得比较多的构建形式，TCE通常基于抗体或抗体片段，能够将体内的T细胞与表达TAA的肿瘤细胞或表达特定标志物的其他免疫细胞桥接起来。T细胞激活需要至少两个信号，其中第一信号是由T细胞受的靶向CD19和CD3的Blinatum同一靶抗原上的不同结构域等多种情况PF-07275315，临床2期，靶向IL-13/IL注：ADCC：抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用；ADCP：抗体依赖的细胞吞噬作用；CDC：补体依赖的细胞毒性；EGFR：表皮生长因子受体；BCMA：B细胞成熟抗原；第第4期许林，等：三特异性抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展435436生命科学presentingcell,APC)或肿瘤细胞表面上的组织相CD28分子与APC上的共刺激分子(如B7家族分子CD80和CD86)的相互作用[8-9]。共刺激分子或共抑制分子及其配体参与了T细胞的活化、增殖，的是B7/CD28家族和肿瘤坏死因子受体超家族的LAG-3等[10]，通过结合这些调节分子可调节T细胞的功能变化。三特异性T细胞接合器可以分为三成都恩沐生物科技有限公司的CMG1A46(BR110)药物为靶向CD3/CD19/CD20的三特异性抗体，其适应证为急性淋巴细胞白血病(ALL)、NHL、血液肿瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B淋巴瘤，现已进行到临床1/2期(NCT05348889)。CD19是B细胞表达的一种CD分子，属于从细胞性或正常B细胞上表达，促进其增殖和激活[12]。CD20是一种多程跨膜蛋白[13]，是研究最广泛的B细胞抗原之一，有50%左右的B前体ALL患者的B细胞表达CD20。根据博锐生物公司官网，CMG1A46同时靶向T细胞表面的CD3以及B细胞上的两个抗原表位CD20和CD19，通过募集CD3+T细胞增强T细胞功能，介导B细胞耗竭并最终杀死表达CD19和(或)CD20的B细胞。选择CD19和CD20作为靶抗原具有一定的优势：首先，CD19和CD20能够在绝大多数恶性B细胞上表达[14]；其次，两种抗原同时丢失的可能性很第4期许林，等：三特异性抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展437扩大细胞识别能力的同时，不易产生肿瘤外毒性增加的副作用[16]。此外，CD3/CD19/CD20靶点联合治疗的药物在体外肿瘤细胞系和原代血液样品中表现出高度的选择性效力，具有活化、增殖T细胞和产生细胞因子的能力，且有望降低细胞因子释放综在人外周血单个核细胞(PBMC)移植的非肥胖糖尿病(nonobesediabetes,NOD)小鼠模型中，注射CMG1A46药物可诱导(CD19+/CD20+)Jeko-1淋巴瘤和(CD19+/CD20-)A20-hCD19肿瘤的快速消退并同时展示出了强大的抑瘤活性。在食蟹猴的药代剂量提高到原先的10倍毒性也未明显增加，未出现显著不良反应。因此，CMG1A46的效力高、毒性可控且在血清中具有天然IgG样半衰期，具有良此CD28可抑制T细胞死亡从而提高T细胞杀伤肿瘤细胞的持久性[20-21]。赛诺菲公司的SAR-442257药物为靶向CD3/CD28/CD38的三特异性抗体，其适应证为MM、NHL，现已进行到临床1期(NCT04401020)。赛诺菲的两种三特异性抗体药(Anti-CD3/CD28/HER2)[6]让科学家们重新关注到Anti-CD3/CD28/CD38能够提供两种信号，以充分和持久地激活T淋巴细胞，并将其聚集到肿瘤细胞周围杀伤肿瘤[22]。合理设计出更紧密的免疫突触，可以进一步增强对肿瘤的杀伤能力。因此，相比于势在于能更彻底、更持久地激活T细胞，瘤活性。不过激活T细胞不可避免地会导致CRS，小鼠模型中进行药物测试，结果显示SAR-442257人灵长类动物(nonhumanprimate,NHP)的记忆/效原代CD8+T细胞重建的NSG小鼠，接种素酶报告基因的NCI-H929人多发性骨髓瘤细胞，通过荧光成像技术监测抗体治疗后的生长情况，发现CD38三特异性抗体的效果显著，剂量低至1μg/kg即可明显抑制肿瘤的生长[22]。因此进一步证明，共刺激信号可以阻止T细胞凋亡。通过给猴子静脉注射SAR-442257，发现并未有明显的CRS。导的T细胞活化，增加CRS的风险[25]。不过药物对正常细胞的数量影响不大，在接受抗体治疗的猴免疫检查点是一类抑制人体免疫应答的免疫抑制性分子，包括其配体和受体及之间的信号通路，正常细胞通过表达免疫检查点配体，与免疫检查点分子结合传递抑制信号，来抑制细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTcell,CTL)的激活，从而避免正常细胞受到免疫攻击，但同时癌细胞会利用该机制形成疫逃逸，从而抑制对肿瘤的免疫作用，导致肿瘤发 免疫检查点抑制剂共抑制免疫应答的配体和受体结合及其信号转导，从而进一步激活免疫细胞，恢复宿主免疫系统的攻击能力以抵御肿瘤细胞。在临床上，ICB能改善患者疗效，缓解化学治疗、放射治疗等带来的副作用，有效延长患者的生存期。若单独使用免疫检查点抑制剂，其抗肿瘤效果仅在部分患者中响应并且易产生耐药性[26]。因此，免疫检查点抑制剂更多地被应用于联合疗法或开发成双/多特异性抗体，通过与免疫激活受体结合激活免疫细胞，或两个免疫检查点抑制剂进行组合来常见的免疫检查点包括PD-1/PD-L1及CTLA-4，均在不同类型的实体瘤临床治疗中有所成效。PD-1是免疫细胞上表达的一种跨膜蛋白，与PD-或PD-1/PD-L2信号通路使肿瘤细胞逃逸细胞毒性故PD-1可作为免疫检查点阻断疗法的潜在靶点。另一种常见的免疫检查点PD-L1，在肿瘤细胞上高表达，其表达与免疫细胞的浸润程度成正比[27]。通过PD-1/PD-L1及CTLA-4免疫检查点抑制剂可438生命科学解除肿瘤细胞对免疫系统的抑制，激活免疫细胞再识别、监视肿瘤细胞，发生免疫介导的肿瘤应答，Numab公司在研的ND-021药物是靶向4属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，主要表达于活化的T细胞，是T细胞协同刺激分子，其配体为公司进行了多项多特异性药物的研发。ND-021即是下一代多特异性癌症治疗药物，可同时靶向肿瘤免疫抑制性PD-1/PD-L1通路和肿瘤免疫刺激性的协同效应。同时，ND-021的结构域通过结合的分子设计旨在高效，同时仅局部激活肿瘤定向的Numab公司于2018年在美国癌症研究协会(AmericanAssociationforCancerResearch,AACR)性优于PD-1/PD-L1阻断剂及其与针对共刺激受体的抗体的结合。在2022AACR年会上，Numab公布了部分临床前数据：在两种不同异种移植模型的人源化小鼠中，ND021注射后不仅增强了瘤内CD8+T细胞的增殖性，而且与αPD-L1和α4-1BBPD-L1/4-1BB/HSA三特异性抗体的耐受性更佳。而食蟹猴中的药代动力学/药效学研究也进一步证实了该抗体的稳定性、药理活性、耐受性和半衰高剂量ND021会维持对4-1BB的刺激，且刺激作用呈剂量依赖性持续增加，直至达到最高药物剂量NK细胞接合器的结构与TCE类似，一只手臂靶向癌细胞，另一只手臂靶向NK细胞，外加一个增强NK杀伤功能的靶点，如细胞因子或NK激活受体，也可以是另一个TAA。NK细胞的活性受多种激活和抑制受体的分子调控，在细胞因子方面主要是IL-15，用以激活NK细胞和记忆性CD8+T细目前设计的NK细胞激活剂主要是用于治疗血液AML)中高表达而在正常造血干细胞中表达相对较高表达与高残留病灶呈正相关，提示预后不良。CD16属于Ig超家族成员，参与抗体依赖性的细胞毒性作用，同时是NK细胞的核心标记之一。NK细胞可通过细胞表面抗原CD16与肿瘤特异性IgG抗体结合，识别并杀伤与IgG抗体特异性结合的肿瘤细胞。NKp46是一种在哺乳动物中高度保守的活常在静止和活化的NK细胞上表达，可介导NK细第4期许林，等：三特异性抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展439赛诺菲与Innate公司合作，利用Innate公司专有的多特异性抗体平台ANKET开发了一款基于NKp46/CD16的NK细胞接合器S同时，AML患者在诊断时，NK细胞中的NKp46CD64的表达能使其对抗CD123抗体产生耐药性，而SAR443579通过与CD16a和NKp46的结合协同激活NK细胞，将NK细胞重定向到癌症靶点，可以规避这种耐药性[33]，同时利用NK功能对抗癌细胞的优势，诱导肿瘤细胞裂解，因此SAR443579的首次人体临床试验结果显示，剂量高达3mg/kg每周一次时耐受良好，并观察到CDE官网显示，注射用SAR443579已获批临床，(FCGR3B)两种蛋白，CD16a是NK细胞表达的最有效的激活受体[34]，且CD16a是唯一可以自行激活NK细胞的受体，无须通过其他受体进行额外激。NKG2D是一种Ⅱ型跨膜受体，存在于所有小鼠和人的NK细胞中。HER2是一种位于细胞膜癌患者中高表达，因此可作为乳腺癌的潜在免疫治达，因而许多HER2低表达实体瘤患者也可能受益通过CD16a/HER2/NKG2D靶点联合治疗的在研三特异性抗体主要有DragonflyTherapeutics公司的DF-1001药物，借助该公司的TriNKET™平台开发，这是目前在研TriNKET™产品线中最先进的候选药物，适应证为实体瘤，现已进行到临床ADCC作用，NKG2D可以充当共刺激受体，其信号转导能增强T细胞功能和TCR活化[39]。作为一种多功能受体，NKG2D可与靶细胞表面多种配体分子直接结合[40]，但NKG2D配体在正常细胞表面安全性，其次是治疗疗效。针对36例晚期和(或)难治性实体瘤患者进行剂量递增治疗，有79%的患者报告了治疗相关不良事件，但大多是低级别；其中22例患者病情稳定(stabledisease,SD)，临床在2023年举办的ASCO年会上首次发表了DF1001剂量升级的1期结果，在Dragonfly公司对该药物进行的1/2期临床试验中，用单药DF1001治疗了106例患者，疗效安全且耐受性良好。在患者开始显示出肿瘤组织NK细胞和(或)CD8+T细胞浸润2.4.1GB263T(Anti-EGFR/以嘉和生物药业有限公司的三特异性抗体EGFR和两种不同的cMET表位[43]，目前处于1/2期临床研究(CTR20221422)。GB263T可显著增强其EGFR靶点结合两个Fab，在EGFR的Fc片段引入了Fc效应功能增强突变体，增强其ADCC功能；同时，两种Fab靶向c-Met的两个不同表位，与强生2021年获FDA批准的EGFR/c-Met双特异性抗体Amivantamab(JNJ-37GB263T可显著降低EGFR和c-Met的表达水平，抑制下游信号通路，并在多种肿瘤模型的体内药效实验中显示出显著的抗肿瘤活性[1]。在EGFR突变患者中进行的首次人体1/2期研究通过药物的初步剂量递增，评价药物的耐受性和安全性，并评估其初步疗效、药代动力学和免疫原性。结果显示，6例患者中有5例出现治疗相关不良反应，但均为轻血管内皮生长因子(VEGF)是一种高度特异性促进血管内皮细胞迁移增殖等作用。VEGF及其受440生命科学体(VEGFR)组成的VEGF/VEGFR2通路是开发抗血管生成药物的主要靶标，且VEGF在肿瘤微环境(tumormicroenvironment,TME)中的过表达具有抑拓维创新生物科技有限公司在研的TAVO-412创生物专有的平台设计和改造而成，其适应证为实TNBC)、肺癌、胰腺癌、胃癌，现已进行到临床1期(NCT05548634)。TAVO-412是一种人源化多特异性抗体，具有两个不同的抗EGFR纳米抗体结构域、一个抗cMetFab臂和一个抗VEGFScFv结构。VEGF具有促进黏附分子和趋化因子表达的能力，诱导肿瘤血管结构异常，可阻止免疫细胞浸润。因此，TAVO-412在阻断EGFR和cMET信号通路的同时，可以阻断肿瘤内的血管生成，通过多靶点的协同效应提高了在TME中的抗肿瘤疗效。在临床前异种移植模型中，TAVO-412显示出对如，对不同EGFR和cMet受体密度水平的TNBCBT20)展开体内测试研究，结果在多个TNBC细胞系成瘤动物模型中发现了强烈的肿瘤生长抑制效中的TGI达62%[47]。此外，在一项食蟹GLP毒理学研究中，TAVO412也显示出良好的耐纳米抗体又称VHH抗体，是只包含一个重链可变区的单域抗体，分子量仅为普通抗体的1/10，体会被肾小球滤过而清除出体内，导致半衰期短，而与HSA结合则可以显著增强抗体的血清半衰期。靶向HSA延长抗体在体内半衰期的优势如下：患者医疗负担的同时，提高抗体药物自身的疗效；提高患者安全性和抗实体肿瘤活性，具有高度特异性和有效的重定向裂解，从而在HSA存在时表现2.5.1HPN-328(Anti-CD3/DLL3/al可与不同的Notch受体结合。根据不同的肿瘤类型和细胞生长环境，DLL3可发挥出促癌或抑癌的双向作用。DLL3主要分布在神经内分泌类肿瘤的细胞膜上，因此是治疗神经内分泌类肿瘤的有力免疫新型抗体衍生平台开发的HPN-328为靶向CD3/蛋白三个抗体衍生的结合域，其适应证有SCLC，现已进行到临床1/2期(NCT04471727)[53]。HPN-328在神经内分泌类肿瘤中的I/IIa期研究中也显示出初步疗效[54]。在1mg/kg和10mg/kg量下，在NHP中耐受性良好，无不良的生化变化经内分泌前列腺癌(neuroendocrineprostatecancer,NEPC)和其他神经内分泌肿瘤患者，初步证据表明HPN-328对这些肿瘤都具有抗肿瘤活性[55]。在≥13例肿瘤病灶减少，客观缓解率为25%，疾病控制2.5.2HPN-536(Anti-CD3/MSLN/a间皮素(mesothelin,MSLN)在腺癌、卵巢癌和肺腺癌等多种人类癌症中呈现高表达，而在健康细胞中低表达的特点使得其成为了一通过CD3/MSLN/albumin靶点联合治疗的在研三特异性抗体主要有Harpoon公司的HPN-536，它是经典的TriTAC模式(VHH-VHH-scFv)，三个结构域分别结合CD3、TAA和HSA，其中结合CD3表位的抗体为单链抗体(scFv)，结合HSA和TAA的抗体为纳米抗体。HPN-536的适应证有胰腺癌、卵巢癌、肺癌和间皮瘤，现已进行到临床1/2期(NCT03872206)。HPN-536在NHP、啮齿动物模型向靶细胞裂解依赖于TriTAC分子与肿瘤细胞表达药代动力学特性。其次，在活性方面，HPN-536与第4期许林，等：三特异性抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展441似的高生物活性。而半衰期的延长依赖于HPN-536的第三个结构域与血清白蛋白的结合，从而增加了药物在癌症患者免疫治疗中的临床活性，发挥更加2.5.3CB-307(Anti-4-1BB/PSMA/al4-1BB是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员[57]，多由活化的T细胞和其他克雷桑多生物科技公司(CrescendoBiologics)在研的CB-307为靶向4-1BB/PSMA/albumin的三到临床1期(NCT05836623)。利用其配体4-1BBL殖并分泌细胞因子，提高机体的免疫应答水平[61]。4-1BB虽然在静息的CD4或CD8T细胞中表达量低，但T细胞在被抗原刺激时，4-1BB表达量会随代表了一种有吸引力的肿瘤免疫治疗靶点[64]。PSMA的表达水平与雄性激素的转移和前列腺癌的中表达水平较低[59]，因而成为了转移性PC免疫治疗中有希望的分子靶点[68]。在表达人PSMA的小鼠模型中进行的药理学研究显示，CB-307能显著抑制肿瘤生长。同时，在食蟹猴中评估CB-307的非临床毒理学和药代动力学，结果显示药物耐受性此外，使用非免疫球蛋白作为支架来构建多特异性抗体也是一种选择。其中，DARPins是基于自然产生的锚蛋白重复结构域，该重复结构域是一个可以产生多特定蛋白的支架，可用于构建多特异性2.6.1PF-07275315(Anti-IL-13/IL-4IL-7)细胞因子，主要在肺、皮肤和肠道屏障表面族的重要成员，IL-4和IL-13受体亚基在正常情况下低表达，二者皆是诱导和维持炎症反应的关键细可通过抑制相应的细胞因子产生从而改善疾病的症状，例如辉瑞公司的PF-07275315为靶向IL-13/已进行到临床2期(NCT05995964)。IL-4可以诱导胞的增殖，引导免疫球蛋白类向IgG4和IgE转化，且在过敏性炎症和哮喘中也起关键作用。IL-13是一种免疫调节细胞因子，主要由活化的Th2细胞分TSLP能激活第2型先天淋巴细胞(typeⅡinnatelymphoidcells,ILC2)[75]，从而诱导先天辅助并诱导Th2细胞分化[76]，进一步产生Th2细胞因时TSLP会触发丝聚蛋白基因缺陷皮肤中的Th22因此，靶向抑制TSLP及其相关的细胞因子IL-4、2.6.2PM8003(Anti-PD-L1/TGF-VEGF在TME中的过表达可以抑制免疫效应细胞并激活免疫抑制细胞，从而驱动TME中的免药物的疗效。转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)是一种肿瘤抑制因子，通过阻断肿瘤细胞周期进程抑制肿瘤增殖，且TGF-相关基因上调与肿瘤治疗的耐药性有关[79]。普米斯生物技术公司在研的PM-8003药物是靶向PD-L1/TGF-β/VEGF的三功细胞的数量，增加效应T细胞的活性，从而恢复对制T细胞浸润来塑造TME以抑制抗肿瘤免疫[79]。抗TGF-β和抗PD-L1的联合应用可以促进T细胞渗透到肿瘤中心并增强抗肿瘤免疫力，且TGF-β可442442生命科学NCTNCT05995964NCT03577028NCT05348889NKCENSCLCNCT04184050NCT04471727NCT03872206ND-021NCT04442126NCT03214666NKCENCT05086315NKCENCT05839626NCT05836623NCT05978284NCT05862012NCT05424822NCTNCT05397496、NCT03705169NCT04401020NCT05013554NCT05548634NSCLC/////NKCE/注：TCE：T细胞接合器；NKCE：NK细胞病；NSCLC：非小细胞肺癌；NHL：非霍奇金淋巴瘤；SCLC第第4期许林，等：三特异性抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展443444生命科学重抑制可能具有更强的抗血管生成作用。此外，TGF-β和VEGF信号转导的双重抑制可以协同减少三特异性抗体是一种具有潜力的多靶点免疫干预手段。相比单克隆抗体和双特异性抗体，三特异性抗体可以同时实现多种作用机制，包括在特异性靶向肿瘤细胞的同时阻断免疫检查点或激活免疫细并且通过灵活的靶标组合可以增强免疫细胞活化或免疫抑制阻断，确保精确有效地杀伤肿瘤。然而，三特异性抗体的发展仍面临一些局限性，值得深入关注和研究。首先，三特异性抗体高度刺激免疫系抗体，由一种减毒的三特异性T细胞接合器(TCE)与抗白细胞介素6受体(IL-6R)结合部分融合而两种抗IL6RscFv融合到TsAb上，TriTECM抗体可以抑制EGFR和IL6R信号通路，并有效触发T细胞介导的细胞毒性。此外，TriTECM介瘤T细胞活性减弱，表明TriTECM具有成为细胞因子释放调节剂的潜力[80]。其次，在某些情况下，抗体药物可能会表现免疫原性，且给药抗体经常诱降低药物的治疗效果或引起严重的不良事件。通过糖基化、聚乙二醇化和序列修饰等，可以在一定程虽然在NHP中展现了可接受的安全性[6]，但在临床应用中仍需要探索降低毒性的方法。其中，一种应对靶向性与非靶向性细胞毒性的策略是选择性激的BsAb组成，每个BsAb靶向不同的TAA。肿瘤只有当两个抗体分子同时与同一个肿瘤细胞的双靶点结合时，CD3结合域的两部分才能结合并产生功能完备的抗CD3结合域。在上述方法中，HLE结构域在蛋白水解激活时丢失，若TCE的活性形式从肿瘤中释放出来，则可以降低全身副作用的风措施还包括控制剂量、改变给药方式、临床预防性其中，使用皮下而非静脉注射的给药方式，可以减缓抗体暴露的速度，避免注射大量抗体而过度激活T细胞，或按照最低预期生物效应水平剂量来缓解全身毒性，以上举措有助于降低安全风险。最后，多特异性抗体的结构具有一定复杂性，生产工艺难度会随着与抗体相关的特异性靶标数量增加而增加，纯化环节相较于单抗和双抗更复杂。在三特异性抗体生产和纯化过程中可能会产生蛋白质聚集、生产质量不稳定、杂质较多以及生产收率低等问因此在纯化环节一般需增加层析步骤以去除杂质，但因分子间的相似性使层析分离度降低，若想达到目标纯度就会影响产量。因此，探索一种简单通用的三特异性抗体制造方法，开发有效的纯化工艺尤面临挑战的同时，三特异性抗体的研究领域也展现出巨大的潜力和应用前景。选择更有效、更具靶向性的抗体靶点是关键。就目前而言，三特异性抗体的设计主要集中在肿瘤细胞和免疫细胞上，寻找新的靶点以提高三特异性抗体的选择性及其抗肿瘤活性，在靶点组合、抗体形式和序列修饰方面，仍需继续优化。此外，还可探索能够同时靶向四种不同靶标的四特异性抗体。例如，Demaria等[84]报道了一种基于四特异性抗体的自然杀伤细胞接合器受体β链和TAA结合，该抗体药物可以诱导NK细胞在体内和体外增殖，控制局部和弥散性肿瘤，同时触发NK细胞的细胞毒性以及细胞因子和趋化因子的产生。探索三特异性抗体与其他疗法(如放射治疗、化疗、免疫疗法等)的联合应用，以期在副作用可控的条件下，进一步提高治疗效果，也是未来可以发展的方向。相信在不久的将来，三特异[1]YaoY,HuY,WangF.Trispe[2]LuRM,HwangYC,LiuIJ,etal.Developmentoftherapeuticantibodiesforthetreatmentofdiseases.J[3]MullardA.Trispecificantibodiestaketotheclinic.Nat第4期许林，等：三特异性抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展445[4]LyuX,ZhaoQ,HuiJ,etal.Thegloballandscapeofapprovedantibodytherapies.AntibT[5]Trispecificsimproveimmune-cellengagement.Cancer[6]SeungE,XingZ,WuL,etal.AtrispecificantibodyviaCD4cells.Nature,2022,chimericantigenreceptorT-celltherapyforchildhoodrefractoryorrelapsedB-cellacutelymphocasingle-arm,phase2study.LancetOncol,2023,24:[8]KhanM,AroojS,WangH.SolubleB7-CD28familyinhibitoryimmunecheckpointproteinsandanti-cancer[9]WielandA,AhmedR.Immu[10]AggarwalV,WorkmanCJ,VignaliDAA.LA[11]PhillipsR.Non-depletinganti-CD19Bcellinhib[12]Tapia-GalisteoA,Álvarez-VallinaL,SanzL.Bi-andtrispecificimmunecellengagersforimmunotherapyofhematologicalmalignancies.JHematolOncomplexwiththetherapeuticmonoclonalantibodyCD20,anti-CD19CARTcellsforrelapsedBcellmalignancies:aphase1doseescalationandexpansion[15]DuellJ,LeipoldAM,AppenzellerS,etal.Sequentialantigen-lossandbranchingevolutioninlymphomaafterCD19-andCD20-targetedt-cellredirectingtherapy.CD20CAR-engineeredTcellsinrefractory/relapsed[17]ZhangJ,ZhouZ.Preclinicalstudyofanoveltrianti-CD3/CD19/CD20Tcell-engagingantibodyasapotentiallybettertreatmentforNHL.Blood,2020,136:22[18]DuraiswamyJ,TurriniR,MinasyanA,etal.Myeloidantigen-presentingcellnichessustainantitumorTcellsandlicensePD-1blockadeviaCD28costimulation.TcellCD28deficiencyaresusceptibletoskinpapillomavirusesbutareotherwisehealthy.Cell,2021,184:3812-28[20]ZhouXMM,MørchAM,Dustin[21]ZhaoY,CaronC,ChanYY,etal.cis-B7:CD28interactionsatinvaginatedsynapticmembranesprovideCD28co-stimulationandpromoteCD8+Tcellfunctionthetherapeuticefficacyof[23]CobbDA,LeeDW.Cytokinereleasesyndromebiology[24]FehervariZ.Threetargetsarebetterthantwo.Nat[25]GarfallAL,JuneCH.Trispecificantibodiesofferathirdwayforwardforanticancerimmunotherapy.Natur[26]KalbasiA,RibasA.Tumour-intrinsicresistancetoimmunecheckpointblockade.NatRevImmunol,2020,[27]SchoenfeldAJ,RizviH,BandlamudiC,etal.ClinicalandmolecularcorrelatesofPD-L1expressioninpatientswithlungadenocarcinomas.AnnOncol,2020,31:599[28]GundeT,BrockM,Warmutnovel,monovalenttri-specificantibody-basedmoleculethatsimultaneouslymodulatesPDpotentanti-tumoralactivityinvivo.C1532ofhumannaturalkillercells.Cell,2023,1[30]SenSantaraS,LeeDJ,CrespoÂ,etal.TheNKcellreceptorNKp46recognizesecto-calreticulinonER-stressedcells.Nature,2023,616:348-[31]BankU,DeiserK,Plaza-forIL-7/IL-15-dependentNKp46+ILCdevelopmentandprotectionfromintestinalinflammationinmice.Nat[32]KrzywinskaE,SobeckiM,NagarajanS,etal.ThetranscriptionfactorHIF-1αmediatesplasticityofNKp46+innatelymphoidcellsinthegut.JExpMed,2022,219Virone-OddosA,BefacutemyeloidleukemiabyatrifunctionalNKp46-CD16a-NKcellengagertargetingCD123.NatB[34]MengF,ZhangS,XieJ,etareceptorstoremodeltheimmuneresponseforenhaanti-tumorimmunotherapyiniPSC-derivedNKcells.J[35]MyersJA,MillerJS.ExploringtheNKcellplatformf[36]SirhanZ,ThyagarajanA,SahuRP.Theefficacyoftucatinib-basedtherapeuticapproachmetastaticHER2-positivebreastcancer.SeminOncol,[38]UzunparmakB,HaymakerC,RasoG,etal.HER2-lowexpressioninpatientswithadvancedormetastaticsolid[39]CadouxM,CarusoS,PhamS,etal.Expressionof446生命科学andassociateswithHCCaggressiveness.JHepatol,[40]MarinovićS,LenartićM,MladenićK,etal.NKG2D-mediateddetectionofmetabolicallystressedhepatocytesbyinnate-likeTcellsisessentialforinitiationofNASHautologousNKG2D-basedCART-celltherapy,inrelapsedcohortsofthedoseescalation1/2StudyofDF1001,anoveltri-specific,NKcelltherapytargetingHER2,inpatientswithadvancedsolidtumors:phase1DF1001monotherapydose-escalationresults.JClinOncol,2023[43]ZamanM,HuangC,Gallolu-KankanamalageS,etal.AbstractLB069:DevelopmentofcMET/cMET/EGFRtrispecificantibodyas[44]YangJJ,PavlakisN,XieF,etal.Abstracte21085:phaseI/ⅡstudyofGB263T,anotrispecificantibody,inpatientswithadvancedEGFR-mutated(EGFRm)non-smallcelllungcancer(NSCLCClinOncol,2023,41[45]IlsonDH.EmergingevidenceforVEGFandimmunecheckpointinhibitioninoesophagogastriccancer.LancGastroenterolHepatol,2022,7[46]ChiuM.Abstract4494:Multi-specificcMetxEGFRxcMetxEGFRxVEGFantibodyfortriplenegativebre[48]DengZ,ZhangS,SunM,etal.NanobodiesagainstporcineCD163asPRRSVbroadinhibitor.IntJBiol[49]ChuangYM,HeL,PinnML,etal.Agranulocyte-macrophage[50]CaraceniP,O'BrienA,GinesP.Long-termalbumintreatmentinpatientswithcirrhosisandasclassofT-cell-engagingproteinconstructsdesignedforthetreatmentofsolidtumors.MolCancerTher,2021,impairmentafterTIPS:Aroadtobeexplo[53]AaronWH,AustinR,BarathM.AbstractC033:Hananti-DLL3Tcellengagerfortreatmentofsmallcell[55]JohnsonML,DyGK,MamdaniH,etal.Abstract8566:Interimresultsofanongoingphaatri-specific,half-lifeextended,DLL3-targeting,T-cellneuroendocrinecancers.JClinOncol,20[56]MolloyME,AustinRJ,LemonBD,etal.PreclinicalcharacterizationofHPN536,atrispecific,T-cell-actproteinconstructforthetreatmentofmesothelin-expressingsolidtumors.Clin62[57]CappellKM,KochenderferJN.AcomparisonofchimericantigenreceptorscontainingCD28versus4-1BBcostimulatorydomains.NatRevClinOncol,2021,18:[58]Dual-targetingapproachforCD40and4-1BB.Cancer[59]GiraudetAL,Kryzinmetastaticcastration-resistantprostatecancer:whereareweandwherearewegoing?TherAdvMedOncol,PETandWBMRIasnext-generationimagingtoolsin[61]LiL,WenQ,DingR.TheraorTGF-βtoenhanceanti-PD-(L)1therapy:theevidenfromclinicaltrials.F[62]WuQ,PanC,ZhouY,etal.Targetingneuropilin-1abolishesanti-PD-1-upregulatedregulatoryTcellsandL1/4-1BBbispecificantibody-anticalinfusionproteinPRS-344/S095012elicitsstrongT-cellstimulationinatumor-localizedmanner.ClinCancerRe[64]PichlerAC,CarriéN,CuisinierCD137(4-1BB)signalingpromotesCD8+-exhaustedTcellproliferationandterminaldiffere[65]GuptaS,HalabiS,YangQ,etal.PSMA-positivecirculatingtumorcelldetectionandoutcomeswithabirateron