致泻大肠埃希氏菌肠出血性大肠杆菌O157-：H7

致泻大肠埃希氏菌肠出血性大肠杆菌O157：H7一、概念及分类地位二、生物学特性三、卫生学意义四、检测方法五、希望内容提要一概念及分类地位致泻大肠埃希氏菌（enterovirulentE.coli）：大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，可引起腹泻等疾病的一群大肠杆菌。一概念及分类地位埃希氏菌属大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌肠道致病性大肠埃希氏菌EPEC肠道出血性大肠埃希氏菌EHEC产肠毒素大肠埃希氏菌ETEC肠道侵袭性大肠埃希氏菌EIEC肠杆菌科一概念及分类地位致泻大肠埃希氏菌肠致病性大肠杆菌（EPEC）：是婴儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死；成人少见。

肠出血性大肠杆菌（EHEC）：引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素。

肠产毒性大肠杆菌（ETEC）：引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍乱样症状。

EIEC引起痢疾样的腹泻和脓血便，有的并引起较大规模的食物中毒、医院内感染或水源性腹泻的爆发。

肠出血性大肠杆菌（EHEC）：l987年由Levine提出，是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以O157：H7血清型为代表菌株。EHECO157：H7感染可引起程度不同腹泻、出血性结肠炎（HC）、肾溶血性尿毒综合征（HUS）、血栓性血小板减少性紫癜（TIP）等。其中HUS病程凶险，易造成急性肾衰竭乃至死亡。二生物学特性革兰氏染色阴性、两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5µm~0.8µm×1.0µm~3.0µm，因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1~4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好。

在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42℃~44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15℃~46℃。

对理化因素的抵抗力，在无芽胞菌中是最强的一种，在室温可存活数周，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，但将37℃降至4℃过程中，30分钟可杀死此菌。加热60℃，30分钟，此菌可灭活。对漂白粉，酚、甲醛等较敏感，水中1ppb氯可杀死此菌。此菌耐胆盐，在一定程度上能抵抗煌绿等染料的抑菌作用，在选择性培养基配制上，常利用此菌这一性质。

EHECO157：H7其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性，即O157：NM。EHECO157：H7具有较强的耐酸性，pH2.5～3.0，37℃可耐受5小时；耐低温，能在冰箱内长期生存；在自然界的水中可存活数周至数月；不耐热，75℃1分钟即被灭活；对氯敏感，可被1mg/L的余氯浓度杀灭。适宜生长温度为33～42℃，37℃繁殖迅速，44～45℃生长不良，45.5t停止生长。除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌基本相似，EHECO157：H7虽然有uidA基因，但其编码的β—葡萄糖醛酸酶无活性，不能分解4—甲基伞形酮—β—D—葡糖糖醛酸苷（MUG）产生荧光，即MUG阴性。三卫生学意义在卫生学上被用于饮水，牛奶或食品等的粪源性污染卫生细菌学指标

是国际上公认的卫生监测指示菌

作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标

多年来，致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例始终位于第二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性致泻性大肠杆菌亦可常年引发人体腹泻，以夏秋季为高峰，在患者感染住院率中，婴幼儿占60%以上近来，国家质检总局从美国进口的鸡腿中多次检出O157：H7型大肠杆菌，并将其销毁处理。鉴于出血性大肠杆菌O157：H7对食品卫生的重要性，世界卫生组织于1997年4月-5月召开专家会议，讨论防制措施，提出将汉堡包、碎牛肉、生乳、苹果汁、酸奶、奶酪和发酵香肠等列为重点注意的食品。1982年在美国首次发现O157：H7型大肠杆菌。此后，在美国、英国、加拿大、澳大利亚接连不断发生。1993年美国发生了700人感染的暴发流行。至今美国共暴发流行60多起，每年约2万人感染。1996年夏天，日本这个号称世界上最干净的国家里暴发由O157：H7型大肠杆菌污染萝卜苗及牛肉而导致的集体食物中毒事件，波及东京、大阪、京都等40多个府县，患者累计达9000余人，7人死亡。肠产毒性大肠杆菌肠致病性大肠杆菌肠侵袭性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌感染部位小肠小肠大肠大肠腹泻类型水泻水泻痢疾样血性腹泻易感人群婴儿，成人婴儿成人，儿童各种年龄分布发展中国家（热带）世界各地世界各地北美，日本流行病学散发或暴发婴儿腹泻及旅游者腹泻散发或暴发婴儿腹泻散发或暴发，常见于年龄较大儿童引起散发性或暴发性出血性结肠炎致病机理LT，ST定居因子细胞毒素定居因子侵袭肠粘膜细胞细胞毒素常见O血清型6，8，15，20，25，27，78，148，1592，26，44，55，86，111，114，119，125，126，127，128，142，146，158

28，29，112，124，136，143，144，152，164，167

O157：H7，O157：NM鉴定测定LT、ST，检出定居因子血清型血清型与临床表现血清型测定细胞侵袭力血清型四检测方法1、致泻大肠埃希氏菌经典培养生化鉴定法2、肠出血性大肠杆菌O157：H7经典培养生化鉴定法显色培养筛选法

PCR方法实时PCR方法

VIDAS快速筛选法

BAX®全自动PCR方法免疫磁珠富集方法

胶体金方法

由于传统经典检测方法的检测水平只能达到200cfu/g，而食品、环境等样品中EHECO157:H7含量较低，且该菌的致病量为3cfu/g针对EHECO157：H7的检测技术和方法不断改进和创新，现已研究建立6-10种检测方法。

1致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法）1.1增菌1.2分离1.3生化试验1.4血清学试验1.5肠毒素试验(略)1.6结果报告非常重要1致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法）1.1增菌以无菌操作取检样25g（mL），加在225mL营养肉汤中，均质，取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内，于36℃±1℃培养6h。挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18h。1.2分离将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36℃±1℃培养18h～24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。1.3生化试验（1）接种三糖铁琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（KI）、蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶，在36℃培养过夜。（2）TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。

1致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法）1.4血清学试验假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。证实试验：制备O抗原悬液，稀释至与MacFarland3号比浊管相当的浓度。原效价为（1:160）～（1:320）的O血清，用0.5%盐水稀释至1:40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于50℃水浴锅内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该O抗原。1.5肠毒素试验1.6结果报告:综合生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告检测周期:4-6天，灵敏度差，易造成漏检2肠出血性大肠杆菌O157：H7（经典培养生化鉴定法）检样25g

225mLm(EC)n肉汤增菌41℃24h10-4、10-5、10-6三个稀释度0.1mL，涂布SMAC（山梨醇麦康凯琼脂平板）37℃24h挑取5-8个无色菌落转种MUG、LST发酵管培养基37℃、24h，挑阴性培养物转种普通营养琼脂

可按仪器生产厂说明采取；vidas快速筛选法45min可获初步结果阳性反应者作进一步证实生化反应鉴定血清凝集鉴定EHEC乳胶凝集试验或2肠出血性大肠杆菌O157：H7

（VIDAS快速筛选法）检测原理VIDAS快速筛选检测EHECO157：H7，是一种在自动VIDAS仪器上进行的酶联荧光免疫分析（ELFA）方法。固相容器（SPR）：一个类似子加样头样的一次性使用装置，在检测中起固相和加样器作用，SPR用抗EHECO157：H7抗体包被。各种试剂均密封在试剂条内。所有检测步骤均自动由VIDAS仪器完成．煮沸过的增菌肉汤加入试条孔后，在特定时间内，样品在SPR内、外反复循环。标记有碱性磷酸酶的抗体也在SPR内、外循环并与固定在SPR壁上的EHECO157：H7抗原结合，最后洗去未结合的抗体标记物。SPR中所用荧光底物为磷酸4—甲基伞形物。仍结合在SPR壁上的酶将崖化底物转变成具有荧光的产物，4—甲基伞形酮。在VIDAS中由光扫描器检测该荧光强度，试验完成由计算机自动分析结果，得出检测值，并打印出每份样品的实验报告。

2肠出血性大肠杆菌O157：H7

（VIDAS快速筛选法）样品制备225mLmEC+n中加入25克（25mL）样本；已加工的肉，向225mLmEC+n中加入50克样本，37℃振荡（120rpm）孵育24小时。

检测步骤（1）VIDASEHECO157：H7试剂盒恢复到室温（2）其余试剂放回2～8℃贮存。（3）标记（4）输入信息建立worklist（5）将对照液或样品加入ECO试剂条样品孔中央（6）将ECO试剂条和EEOSPR放入VIDAS仪相应位置（7）根据VIDAS操作手册开始检测步骤。检测约需45分钟。（8）所有用过的SPRs和试条丢弃子适当容器。2肠出血性大肠杆菌O157：H7

（VIDAS快速筛选法）结果判断每份样品有两个荧光读数，第一个数值表示SPR未加入底物时容器和底物的本底。第二个数值则表示SPR内面的酶复合物与底物反应后的结果，该数值减去本底后则为相对荧光值（RFV）。检测值则是由每份样品的RVF与标准对照值相比得出的。从样品和对照得出的检测值再与计算机存储的阈值比较。当检测结果阈值<0.10时,表示样品检测结果为阴性。当检测结果阈值≥0.10时,表示样品检测结果为阳性。优点：快速性（1-2天）、特异性、准确性、灵敏性2肠出血性大肠杆菌O157：H7（BAX®全自动PCR方法）检测原理BAX®EHECO157：H7检测系统是应用多重PCR技术检测食品中的EHECO157：H7的自动方法。自动化的BAX®系统的检测对象是EHECO157：H7特有的一段DNA片段，此片段是稳定的，而且不受环境的影响。只需要很微量的EHECO157：H7，BAX®系统的PCR技术就可以扩增出目的DNA片段。因此提供了一个十分可靠的证明：即此生物是存在的。BAX®系统通过合并必要的引物，多聚酶和核酸，使其成为一个稳定、干燥、人造的药片，并被装入PCR管中，从而使PCR过程简单化。扩增后，这些管对检测片段一直保持密封，因此显著降低了一种或多种PCR扩增产物的潜在污染。一旦扩增反应开始，BAX®系统PCR片剂中的荧光染料就会与双链DNA结合，光照时发出荧光信号。扩增反应后，BAX®系统开始检测，接着自动化的BAX®系统利用荧光检测来分析PCR产物，从而得到阳性或阴性结果。

2肠出血性大肠杆菌O157：H7（BAX®全自动PCR方法）操作步骤（1）样品制备、增菌培养和分离见经典培养生化鉴定方法。（2）细菌模板DNA的制备按BAX®系统EHECO157：H7检测试剂盒说明书进行。（3）BAX®系统EHECO157：H7检测按照BAX®用户指导书来准备试剂、进行检测和读取结果。必须按照实验室工作指南来装配、操作设备并记录使用情况。结果判断和报告（1）BAX®检测结果为阴性的样品可以出具阴性报告。（2）检测结果为阳性的样品需要继续按照传统的方法进行确认。（3）检测结果显示不确定或错误的样品，需要用BAX®系统进行确认，直至显示为阴性或阳性的结果为止。优点：快速性（1-2天）、特异性、准确性、灵敏性2肠出血性大肠杆菌O157：H7

（免疫磁珠富集方法）检样25g

传统的增菌培养取一定量的增菌液+Dynabeadsanti-O157磁珠反应一定时间在磁场中倒掉液体用缓冲液清洗几次

收集磁珠+E.ColiO157复合体

在选择性培养基上进行培养

优点：准确率高、可靠、灵敏度高，特异性强。2肠出血性大肠杆菌O157：H7

（胶体金方法）原理Reveal®大肠杆菌O157：H7菌检测系统是利用不同富集培养基，为大肠杆菌O157：H7提供易利用的营养成分，以及其它大肠杆菌O157：H7生存及快速生长的必要因子，可在8小时内获得结果。使用细菌学分析指南（BAM，1998）或USDA/FSIS提供的富集培养基，结合Reveal检测装置,可以在20小时内完成检测。将少量富集培养物（120µL）滴加到Reveal检测卡的圆形样品区内，样品通过毛细管作用渗过含特异性大肠杆菌O157：H7抗体（与胶体金颗粒相偶联）的试剂区。如果样品中存在抗原（即大肠杆菌O157：H7），它将与胶体金标记的抗体结合。该抗原-抗体复合物渗过试剂区，经过含有大肠杆菌O157：H7抗体（分布呈带状）的硝化纤维膜。该含金免疫复合物被捕获并聚集在这个区域，从而显示一条可见的线。剩余的样品继续迁移而进入位于膜末端的废液贮存处。试剂区也含有针对广谱抗原的金复合物（指示剂），无论大肠杆菌O157：H7存在与否，它都会被样品溶液释放。胶体金复合物对照指示剂通过膜迁移到阴性对照捕获区（含针对广谱抗原的抗体区），捕获并集结成一条可见线。无论大肠杆菌O157：H7抗原存在与否，都会在对照区形成对照线，以保证检测过程操作正确无误。2肠出血性大肠杆菌O157：H7

（胶体金方法）检测步骤（1）培养基制备：将1瓶Reveal8小时培养基（或Reveal8小时改良培养基）加入到消毒的无菌袋内，加入225mL42℃的无菌水，用力混匀，直到溶解。使用前培养基保持在42℃，但是不要超过6个小时。最好是制备好立即使用。（2）加样：取25g样品到无菌袋内，使样品混匀，确保彻底混匀；（3）培养：松散地紧闭袋子42±1℃培养8小时。（4）混匀：8小时培养后，从温箱中取出袋子，抓牢袋子离顶部2-3英寸处，支撑底部，并用一边到另一边的方式剧烈混匀。（5）样品处理：使用无菌吸管，移取5mL样品到聚丙烯或玻璃试管内，加热：如果使用聚丙烯试管，放置于水浴中20分钟；使用玻璃试管，放置水浴中10分钟；或者将试管放置于微