化学品 藻类生长抑制试验 征求意见稿

1GB/T21805—XXXX化学品藻类生长抑制试验本文件规定了化学品藻类生长抑制试验的受试物信息、试验原理、参比物、试验方法、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。本文件适用于评价具有低挥发性、高环境稳定性且试验条件下可溶于水的受试物对藻类生长的影响。如果要测试挥发性的、强吸附性的、有颜色的、不溶或难溶于水的受试物，以及可能影响培养基中营养物质有效利用的受试物，需要对所述试验程序进行修改（如密闭系统、试验容器的适应等）。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1生物量biomass一定体积试验溶液中活体生物的干重，例如每升试验溶液中含多少毫克藻类干重。生物量通常被定义为质量，但在本文件中，是指单位体积的质量，同时，本文件中，通常测量生物量的替代参数，例如细胞数量、荧光等，因此术语“生物量”也指这些替代参数。2.2变异系数coefficientofvariation标准差与平均数之比，也可以百分比表示，记作CV%。变异系数是一个无量纲的数，因而便于样本间的相互比较。对照组各平行试验平均特定生长率变异系数的平均值按以下方法计算：1）通过试验各阶段对照组各平行试验的生长速率，分别计算得出各阶段的对照组各平行试验平均特定生长率变异系数；2）将上述1）等到的所有数据进行平均，得出对照组各平行试验平均特定生长率变异系数的平均值。2.3效应浓度effectconcentration；ECx暴露期（或偏离完整或常规试验周期，应说明）内，与对照组相比，引起受试生物生长下降x%（如50%）的受试物浓度。EC有基于生长率的ErC和基于生长量的EyC之分。2.4藻类生长培养基growthmedium藻类暴露于受试物时，其生长所基于的完全人工合成的培养介质。通常将受试物溶于培养基（配制试验液）。2.5生长率growthrate2GB/T21805—XXXX即平均特定生长率（averagespecificgrowthrate），是暴露期间生物量的对数增长。2.6最低可观察效应浓度lowestobservedeffectconcentration；LOEC一定暴露期内，与对照相比，对藻类生长有明显（p<0.05）抑制效应的最低试验浓度（受试物设置浓度）。高于LOEC的所有试验浓度均可观察到与LOEC相同的或更严重的毒性影响。如果未满足该条件，须就LOEC（以及NOEC）的选择进行详细说明。2.7无可观察效应浓度noobservedeffectconcentration；NOEC紧临并低于最低可观察效应浓度（LOEC）的试验浓度（受试物设置浓度）。2.8反应变量responsevariable用于估计毒性的变量，该变量源自通过不同计算方法描述生物量的任何测量参数。本文件中指生长率和生长量。2.9特定生长率specificgrowthrate暴露结束时生物量自然对数与暴露开始时生物量自然对数之差与试验周期的商，以每天生物量的对数增长表示。2.10暴露结束时生物量与暴露开始时生物量之差，以反映试验期间生物量的增长。3受试物信息3.1以下受试物信息对于确定试验条件可能有用：a)结构式；b)纯度；c)光中的稳定性；d)试验条件下的稳定性；e)吸光性；f)水解离常数（pKag)转化方面的研究结果，包括水中的生物降解试验结果。3.2以下受试物信息应该已知：a)水中溶解度；b)正辛醇-水分配系数（POW）；c)蒸气压；d)试验条件下有效的受试物定量分析方法，包括注明回收率和检测限。4试验原理3GB/T21805—XXXX本试验的目的是确定受试物对淡水微藻和/或蓝藻生长的影响。将呈指数增长的藻类通过分批培养，暴露于受试物。试验周期通常72小时。尽管测试持续时间相对较短，但可以评估对藻类几个世代的影响。与无受试物暴露的对照相比，暴露于不同浓度的受试物，藻类生长会受到不同程度的抑制，将生长抑制效应作为暴露浓度的函数进行评估。测量藻类在营养充足、连续光照足够长时间的条件下不受限制地呈指数生长时的特定生长率的降低，以充分表达受试物的毒性效应（达到最佳灵敏度）。测量不同时间藻类的生物量，以量化藻类的生长和生长抑制。但因藻类干重难以测量，使用替代参数。在这些替代参数中，最常使用细胞计数。其他替代参数包括细胞体积、荧光、光密度等。测量的替代参数和生物量之间的换算系数应该是已知的。测试终点为生长抑制，以试验期间生物量对数增加（特定生长率）的降低来表达。根据一系列试验浓度下的平均特定生长率，确定引起特定生长率降低达另一反应变量是生长量，即暴露结束时生物量与暴露开始时生物量之差。根据一系列试验浓度下的平均生长量，确定引起生长量降低达到x%（例如50%）的浓度并表示为EyCx（例如EyC50）。此外，可以统计得出最低可观察效应浓度（LOEC）和(或)无可观察效应浓度（NOEC）。5参比物3,5-二氯苯酚可作为参比物。对于绿藻，也可使用重铬酸钾作为参比物。定期测试参比物对藻类生长的影响，至少每年两次。6试验方法6.1仪器设备6.1.1试验容器试验容器和其他与试验液直接接触的器皿应完全为玻璃或其他化学惰性材料制成，用于试验前应彻底清洗并灭菌。试验容器通常为具有一定容积的玻璃瓶，如三角瓶，以保证试验期间有足够的试验液用于测试，同时也保证CO2的充分交换。注意必须保证有足够的液体用作分析测量。6.1.2培养设备使用温度控制精度在±2℃范围内的光照培养箱。6.1.3照度计光照强度的测量方法非常重要，特别是光接受器的类型可能影响测量值。最好使用4π的球面照度计（可接受来自各方向各角度的直射或反射光照）或2π球面照度计（可接受来自上方各角度的直射或反射光照）。6.1.4测量藻类生物量的仪器设备细胞计数是藻类生物量最常用的替代参数。用于计数的仪器设备主要有电子颗粒计数仪、带计数室的显微镜、流式细胞计数仪等。也可使用流式细胞计数仪、荧光计、分光光度计、色度计等测量其他替代参数。为了在低生物量时进行有效测量，分光光度计吸收池的光径必须至少为4cm。应明确替代参数和藻类干重之间的转换关系。6.1.5其他仪器4GB/T21805—XXXX——pH计——电子天平——高压灭菌器等6.2受试生物选择一些不易附着于瓶壁上的绿藻和蓝藻作为受试生物。a）绿藻——近头状尖胞藻（Raphidocelissubcapitata，曾用名：羊角月芽藻/Pseudokirchneriellasubcapitata）——近具棘链带藻（Desmodesmussubspicatus，曾用名：栅藻/Scenedesmussubspicatus）——普通小球藻（Chlorellavulgaris）b）硅藻——舟形藻（Naviculapelliculosa）c）蓝藻——水华鱼腥藻（Anabaenaflos-aquae）——聚球藻（Synechococcusleopoliensis）上述藻类的详细信息见附录A。也可选用其他藻类，但应在报告中说明其品系和（或）来源，并确保在试验期间相应的试验条件下保持指数生长。6.3培养基使用OECD和AAP的藻类培养基，其组成见附录B。注意两种培养基的初始pH值和缓冲能力（调节pH值）不同，因此，所使用的培养基不同，测试结果可能会有所不同，尤其是当受试物在水中离子化程度较高时。有时可能需要对藻类培养基进行修改，例如在测试金属和螯合剂或在不同的pH值条件下测试时，这时应详细描述改良后培养基的使用并证明其合理性。7试验程序7.1试验准备7.1.1藻液的制备为使受试藻类适应试验条件，保证藻类在用于接种试验液时处于指数生长期，试验开始前2-4天在与试验条件相同的试验培养基中进行藻类预培养，制备藻类接种物。应调整藻类生物量，使其在接种物培养中的指数增长占优势，直到试验开始。藻类接种物培养时，应测量接种物培养中藻类生物量的增加，以确保在培养条件下藻类的生长在正常范围内。附录C中描述了藻类培养程序的一个示例。可以反复转接2~3次，经检查藻类生长健壮并正处于指数生长期时即可用来制备试验中需要的藻液。试验时，所有试验液中的藻类的初始生物量应相同并足够低，以保证在营养充足的条件下藻类在成熟期保持指数增长而没有养分耗尽的风险。初始生物量不应超过0.5mg/L干重。各种藻类在试验液中的初始细胞浓度建议如下：近头状尖胞藻（Raphidocelissubcapitata）5×103~5×104个/mL近具棘链带藻（Desmodesmussubspicatus）2×103~5×103个/mL舟形藻（Naviculapelliculosa）104个/mL水华鱼腥藻（Anabaenaflos-aquae）104个/mL5GB/T21805—XXXX聚球藻（Synechococcusleopoliensis）5×104~5×105个/mL7.1.2试验溶液的制备将受试物溶解在经灭菌后的新鲜藻类培养基中配制受试物储备液。试验时稀释成不同的浓度，并接种受试藻类接种物，配制成一系列不同浓度的受试物溶液。所有试验溶液必须包含相同浓度的藻类培养基和藻类初始生物量。如果受试物难溶于水，制备受试物储备液时可以添加适合的溶剂，例如丙酮、t-丁基乙醇和二甲基甲酰胺等。应选用对藻类生长无影响的溶剂，所有试验溶液（包括对照）中溶剂的添加浓度应相同，并且最大允许浓度为100µL/L。7.2试验操作7.2.1预试验为确定正式试验中受试物浓度的设置范围，可以先进行一次预试验。预试验的浓度可按对数间距排布，最低浓度应为受试物的检测下限，最高浓度应为饱和浓度。测量项目和方法可简化，试验时间有时也可缩短。7.2.2正式试验可以根据预试验的结果设置正式试验的受试物浓度范围，最好在对藻类产生5%~75%生长抑制效应之间以几何级数设置受试物浓度系列。至少设5个浓度组，公比应不超过3.2，对于剂量-效应曲线较为平坦的受试物，可能需要更大的公比数。每个浓度3个平行。如果试验不需要得出无可观察效应浓度（NOEC），可以适当减少平行数而增加试验浓度的设置数量。应同时设置空白对照组。对照组至少设3个平行。如果条件允许，对照组平行数为受试组的2倍。若使用溶剂，还应增设溶剂对照组。可以配制一套单独的试验溶液用于受试物浓度的分析测量。7.2.3试验培养试验容器用透气塞封口，放入培养设备中。试验期间，为保持藻细胞的悬浮和CO2的流通，需持续摇动或搅拌。培养温度为21℃~24℃,并保持在±2℃的范围。建议将容器随机摆放并每天改变其在培养设备中的位置。试验期间，对照组pH值的升高应小于1.5。如受试物含有金属或是在试验的pH值下发生部分离子化的化合物，需限制pH值的偏离，以确保获得可重复的良好的试验结果。pH值的偏离小于0.5在理论上是可行的，同时可通过确保有充足的CO2在空气和试验液间交换来实现，例如增大摇动频率。另一个途径是减少初始生物量或缩短试验周期来减少对CO2的需求。试验溶液表面应接收持续均匀的光照，如冷白型或日光型光照。波长在400nm~700nm、光照强度在60µE·m-2·s-1~120µE·m-2·s-1的范围的光照适用于所推荐绿藻生长（对于单位为Lux的照度计，60µE·m-2·s-1~120µE·m-2·s-1大约为4440Lux~8880Lux的冷白光）。培养区域的光强差异应保持在±15%范围内。7.2.4试验周期试验周期为72h。但如果达到质量保证与质量控制的各项要求，也可根据实际情况缩短或延长试验周期。6GB/T21805—XXXX7.2.5测量、分析与观察试验期间，至少每天测量各试验容器中藻类的生物量。如果从试验溶液中吸取少量试验液进行测量，测量完成后，严禁将取出的试验液放回至试验容器中。试验开始和结束时测量试验液的pH值。试验开始和试验期间定期取样分析，以确定各试验溶液的初始浓度以及试验期间的实际暴露浓度。如试验期间受试物浓度维持在配制浓度（或实测初始浓度）±20%的范围内，可仅分析试验开始和结束时最高浓度组、最低浓度组和接近50%生长抑制浓度组中受试物的浓度；如无法维持，则应测量所有浓度组中受试物的浓度。如果受试物具有挥发性、不稳定性或强吸附性，则应每隔24h测量一次，以确定受试物的损失。对于此类物质，可能需要增加平行数。在上述任何情况下，各浓度组只需用1个平行（或将几个平行中的试验溶液合并）来测量受试物的浓度。用于受试物浓度分析的培养基应与试验用培养基经过同样的处理，即接种了藻类且在试验相同的条件下培养。如果需要分析溶解的受试物浓度，需将藻类从培养基中分离。最好使用离心法进行分离，较低转速就可使藻类沉淀。如测量浓度在配制浓度（或实测初始浓度）±20%的范围内，可用配制浓度或实测初始浓度进行结果计算；如超出该范围，则使用实测浓度的几何平均值或根据受试物浓度下降的模型进行结果计算。相较其它绝大多数短期的水生毒性试验，藻类生长抑制试验是一个更加动态的试验系统。试验中实际的暴露浓度难以确定，尤其是对于在低浓度下的强吸附性物质。由于吸附于增加的藻类细胞上，试验溶液中受试物的损失并不意味着它从该试验系统中消失。计算结果时，需核查在受试物浓度降低过程中是否伴随着藻类生长抑制效应的减小。如果发生此类情况，建议使用合适的受试物浓度下降模型；反之则最好采用初始浓度（配制或实测）进行计算。试验结束时，用显微镜观察试验接种的藻类细胞外观是否正常和健康，并记录藻类细胞的任何异常情况（可能由于暴露于受试物中引起的）。7.2.6藻类生长测量方法测量藻类生长的指标和方法很多，建议可以测量以下指标：a）细胞计数在显微镜下，用0.1ml计数框或血球计数板对藻细胞的数量计数。用计数框时可采用视野法，即对显微镜视野中的所有细胞计数。放大倍数40×10，每片至少计数10个视野，如果藻细胞密度小，则要适当增加计数视野，藻数按视野累加。每次计数（同一批取样的样品）应采用相同方法（视野数目、放大倍数等）。每一样品至少计数两次，如计数结果相差大于15应予重复计数。如工作量过大，可先取样，用卢戈氏液固定后保存，留待以后计数。镜检计数工作量较大，有条件时可采用电子颗粒计数仪。b）光密度取一定量的测试液在分光光度计上测量其光密度，波长可选用650nm、663nm或其它波长。亦可用荧光光度计测量。c）叶绿素样品经离心或过滤后，用丙酮、乙醇或其它溶剂萃取，进行分光测量。亦可用荧光光度计测量。7.2.7限度试验如果预试验表明受试物浓度达到100mg/L或试验条件下饱和溶液浓度（该溶解度低于100mg/L）时未对藻类生长产生毒性影响，可进行含有1个对照组和1个浓度组（100mg/L或在试验条件下饱和溶液浓度）的限度试验。进行限度试验，最好有受试物的浓度分析加以佐证。除了平行数增加到至少6个之外，所有有关试验条件、试验方法、质量保证与质量控制的描述均适用于限度试验。对照组和受试组中测得7GB/T21805—XXXX的反应变量需用统计学方法进行比较分析，例如Studentt检验。如果两组的方差不相等，则应进行不等方差调整的t检验。8质量保证与质量控制试验达到以下标准方为有效：a）试验开始的72h内，对照组藻类呈指数增长且浓度应至少增加16倍，即特定生长率大于等于0.92/d。对于常用的试验藻种，生长率远高于此。如试验使用的藻种生长较慢，该标准可能不适用。如果发生此类情况，应延长试验周期，直至对照组藻类呈指数增长且浓度增加16倍。同样，只要对照组藻类保持无限的指数增长且浓度增加16倍，也可缩短试验周期，但至少48h。b）试验各阶段，如0d~1d、1d~2d和2d~3d，对照组各平行的不同阶段平均特定生长率变异系数的平均值应不超过35%。c）整个试验期间，对照组各平行的平均特定生长率变异系数，用近头状尖胞藻（Raphidocelissubcapitata）和近具棘链带藻（Desmodesmussubspicatus）作为藻种时，应不超过7%；用其他非常用藻种时，应不超过10%。d）试验期间对照组溶液pH的变化范围不大于1.5个单位。e）参比物重铬酸钾和3,5-二氯苯酚对近头状尖胞藻（Raphidocelissubcapitata）的72hErC50参考范围分别为0.92mg/L~1.46mg/L和2.08mg/L~4.68mg/L。参比物重铬酸钾和3,5-二氯苯酚对近具棘链带藻（Desmodesmussubspicatus）的72hErC50参考范围分别为0.72mg/L~0.96mg/L和4.04mg/L~8.80mg/L。~9数据与报告9.1数据处理9.1.1绘制生长曲线用测量的替代参数（如藻细胞浓度、荧光性）表示试验容器中藻类的生物量。以表格形式列出24h、48h和72h对照组和各受试组的试验容器中的藻类生物量。以时间为横轴，藻类生物量为纵轴，取各平行的平均值，绘制对照组和各受试组的藻类生长曲线。须使用对数坐标轴，也可使用直线坐标轴。用对数坐标轴作出的生长曲线是一条直线，其斜率就是藻类的特定生长率。观察生长曲线，检查整个试验期间对照组的生长是否达到预期的指数增长。仔细检查所有数据点和图表，核对原始数据和程序是否存在可能的错误。仔细检查可能偏离系统误差的所有数据点。如果发现了明显的程序上的错误或该错误发生的可能性非常高，将相关的数据点标为异常值，并在进行下一步的统计分析时剔除这些数据。（如果其中一个平行中藻类的浓度为零，那可能是该平行试验液中未接入藻类或器皿的洗涤方法不正确）。试验报告中对于作为异常值被剔除的数据应阐明其原因。可以接受的原因仅限于（罕见的）程序错误，而不仅仅是精度差。异常值识别的统计程序对这类问题的用途有限，不能代替专家判断。最好在之后出现的图表中保留异常值。9.1.2选择反应变量试验的目的是确定受试物质对藻类生长的影响。有两个反应变量，分别是平均特定生长率和生长量。使用这两个反应变量计算的毒性值不具有可比性，应用试验结果时必须认识到这种差异。试验条件，基于平均特定生长率(ErCx)的ECx值通常会高于基于生长量(EyCx)的结果，这是由于各自方法的数学基础。8GB/T21805—XXXX这仅仅只是数值在数学上不同，不应被解释为两个反应变量存在灵敏度差异。平均特定生长率是基于藻类在非限制培养中的一般指数生长模式，其中毒性是根据对生长速率的影响来估计的，而不依赖于对照组特定生长率的绝对水平、浓度-反应曲线的斜率或试验持续时间。相反，基于生长量的毒性结果受所有这些其他因素的影响，EyCx取决于每个试验使用的藻类物种的特定生长率和最大特定生长率，而这些在不同藻类之间甚至相同藻类不同菌株之间都可能是不同的。生长量不应用于比较藻类甚至不同菌株对受试物的敏感性。因此科学上更倾向于使用平均特定生长率来估算毒性。9.1.3浓度的换算把显微镜视野计数结果换算为细胞浓度N，见式（1）：式中：Cs为计数框面积（20mm×20mm）Fs=πr2；Fs为视野面积；r＝测量值（mm），r为视野半径；Pn＝n1+n2+∙∙∙+ni（i＝n）；其中N（个/ml）每瓶试样中藻浓度；Pn为n个视野细胞数累加值；ni为第i个视野的藻细胞数。9.1.4计算参数a）特定生长率和基于生长率的抑制率特定生长率，见式（2）。式中：μi-j——从i时间到j时间的特定生长率，单位为每天（d-1Xi——i时间的生物量；Xj——j时间的生物量。对于对照组和各受试组，计算各平行的特定生长率的平均值和方差估算值。采用藻类初始接种生物量的设定值计算整个试验周期（通常0d~3d）的平均特定生长率，比采用测量值计算的更精确。如果生物量测量仪器允许足够精确地测量低接种物生物量（如流动血细胞计数仪可使用初始生物量的测量值进行计算。计算并评估试验过程中每天的（0d~1d、1d~2d和2d~3d）特定生长率，并检查对照组的生长率是否符合质量保证与质量控制的要求。如果与总平均特定生长率相比，第一天的特定生长率相当低，说明第一天藻类处于生长停滞期。通过预培养消除对照组中的生长停滞期或使其最小化，暴露组中的生长停滞表明藻类经受试物作用后可能恢复或由于受试物的损失（包括吸附于藻类）减少了暴露量。因此，为了评价暴露期间发生的受试物对藻类生长的影响，应评价试验各阶段的生长率。如果平均特定生长率和各阶段生长率间存在显著差异，说明藻类未保持持续指数增长，因此，要仔细检查生长曲线。基于生长率的抑制率，见式（3）。9GB/T21805—XXXX式中：Ir——基于特定生长率的抑制率，%；μC——对照组各平行特定生长率的平均值；μT——受试组各平行的特定生长率的平均值。b）生长量和基于生长量的抑制率生长量，计算方法是将每个对照和处理试验容器中暴露结束时的生物量减去起始时的生物量，获得各平行的生长量。对于对照组和各受试组，计算各平行的生长量的平均值和方差估算值。基于生长量的抑制率，见式（4）。式中：Iy——基于生长量的抑制率，%；YC——对照组各平行生长量的平均值；YT——受试组各平行的生长量的平均值。c）计算基于生长率的抑制率或基于生长量的抑制率时，如果试验添加了溶剂，应选择溶剂对照组进行计算。9.1.5绘制浓度-效应曲线以受试物浓度的对数值为横坐标，特定生长率或生长量的抑制率为纵坐标，作回归曲线，即为浓度-效应曲线。绘制曲线时忽略上一阶段定为异常值的数据。通过观察或计算机内插法画一条通过各数据点的平滑线，从而获得初步的浓度-效应关系，然后使用更详细的方法，最好是计算机统计方法做进一步分析。有时，根据数据的质量（精度）和数量以及数据分析工具的可用性，可能会决定（有时是有充分理由的）在此阶段停止进一步的数据分析，并根据初步的拟合曲线获取关键数据EC50和EC10（和/或EC20这取决于数据的预期用途。不使用统计方法的正当理由可能包括：a）计算机处理方法不适用于这些数据，并不能产生比专家判断更可靠的结果——在这种情况下，一些计算机程序甚至可能无法产生可靠的解决方案（迭代可能不收敛等）b）一般的计算机程序不适于处理生长刺激效应。9.1.6统计过程通过回归分析获得定量的浓度-效应关系。对反应数据进行线性变换（如probit变换或logit变换或Weibull变换）后，可以进行加权线性回归。非线性回归能更好地处理不可避免的数据不规范和偏离光滑分布的问题，因此是更合适的方法。但当反应近于零抑制或完全抑制时，数据转换可能会放大不规范性以致影响分析。应注意，在标准的分析方法中，probit、logit或Weibull变换一般用于二元数据（如死亡率或生存率），如果用于生长或生物量数据，则必须进行修改。附录D中进一步详细说明了非线性回归分析的应用。对于要分析的每个反应变量，应根据浓度-效应关系对ECx值进行点估计，可能的话，还应确定每个点估计的95%的置信限。应以图或统计的方式评估反应数据对回归模型的拟合优度。进行回归分析时，GB/T21805—XXXX应使用个体重复反应值而非处理组均值。但是，如果由于数据过于分散而很难或无法进行非线性曲线拟合，则通过对组均值进行回归可避免这一问题，是减少可疑异常值影响的一个实用方法。如果采用这样的处理程序，则应在检验报告中说明，是因为使用个体重复数据进行曲线拟合的结果不好，因此未采用常规程序。如果可用的回归模型/方法不适用于数据，也可以使用自举线性插值法获得EC50的估计值和置信限。为检验受试物对生长率的影响，应使用方差分析(ANOVA)技术比较处理组均值，以估计LOEC进而估计NOEC。然后，应使用适当的多重比较或趋势检验方法将每个浓度组的均值与对照组均值进行比较，Dunnett检验或Williams检验可能是较好的方法。必须用图或正式检验的方法检验ANOVA的方差齐性假设是否成立，这里，Levene检验或Bartlett检验都适用。如果方差齐性假设不成立，可以通过对数据进行对数变换来校正。如果方差表现为极端异质性，且难以通过数据变换来较正，则应该考虑采用step-downJonkheere趋势检验等其他分析方法。近期的科学发展建议放弃NOEC的概念，以ECx替代。但对藻类试验，x的合适取值尚未确定。（根据所选择的反应变量，）x在10%-20%范围内取值似乎都可以，因此EC10和EC20最好都报告。9.1.7生长刺激有时会观察到低浓度的生长刺激效应（负抑制）。这可能是由于受试物的兴奋效应（“毒性刺激”）或将刺激性生长因子与受试物一起添加到所用的藻类培养基中造成的。请注意，添加无机营养元素不应有任何直接影响，因为培养基应在整个试验过程中保持营养过剩。低剂量刺激通常在EC50计算中可以忽略，除非它是极端的。但是，如果它是极端的，或者要计算低x的ECx值，则可能需要特殊计算机程序。如果可能，应避免从数据分析中删除刺激反应，如果可用的曲线拟合软件不能接受轻微刺激，则可以使用带自举的直线内插法。如果刺激是极端的，可以考虑使用兴奋效应模型（hormesismodel）。9.1.8非毒性生长抑制光吸收试验材料可能会导致藻类生长速率降低，因为吸光会减少可用光量。应通过修改试验条件将此类物理效应与毒性效应区分开来，并在试验报告中做出单独说明。9.2试验报告试验报告应包括以下内容：a）受试物.物理属性和相关理化性质，包括水中溶解度；.化学特性（如CAS编号），包括纯度。b）受试生物.藻类的种类、来源或提供者，以及培养条件。c）试验条件.试验开始日期和持续时间；.试验设计：试验容器、培养体积和试验开始时的生物量密度；.培养基的成分；.试验浓度和平行（如平行数、试验浓度数及其公比）；.试验溶液的配制，包括溶剂的使用；.培养设备；.光照强度和光质（来源，是否均匀.温度；.浓度测量：设定浓度和所有实测浓度。应说明添加回收试验的方法和仪器的最低检测限；GB/T21805—XXXX.对本文件的所有偏离；.生物量的测量方法，以及所测参数和干重的关系。d）结果.试验开始和结束时各受试组的pH值；.生物量的测量方法，以及各测量时间各试验容器中的生物量；.生长曲线（生物量-时间）；.计算出的各平行的各参数值，及其平均值和变异系数；.剂量-效应曲线；.评估受试物对藻类的毒性，如EC50、EC10、EC20及其置信区间。LOEC和NOEC及其统计方法（可选）；.如果采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计，说明最小显著差数；.各受试组中任何对藻类生长有刺激效应的结果；.观察到的其他效应，如藻类在形态学上的改变；.结果讨论，包括对偏离的解释说明。GB/T21805—XXXX（资料性）试验藻种A.1生物品系A.1.1绿藻近头状尖胞藻（Raphidocelissubcapitata，曾用名：羊角月芽藻/Pseudokirchneriellasubcapitata）近具棘链带藻（Desmodesmussubspicatus，曾用名：栅藻/Scenedesmussubspicatus）普通小球藻（Chlorellavulgaris）A.1.2硅藻舟形藻（Naviculapelliculosa）A.1.3蓝藻水华鱼腥藻（Anabaenaflos-aquae）聚球藻（Synechococcusleopoliensis）A.2外观和特征表A.1试验藻种的外观和特征subcapitata）subspicatus）pelliculosa）flos-aquae）leopoliensis）40~50ab用细胞大小计算的结果；A.3试验藻种的培养与测量A.3.1近头状尖胞藻（Raphidocelissubcapitata）和近具棘链带藻（Desmodesmussubspicatus）GB/T21805—XXXX多种培养基适用于这两种绿藻。合适的培养基类型可由提供单位获取。单个细胞，细胞密度的测量比较简单，可用电子颗粒计数仪或显微镜。A.3.2水华鱼腥藻（Anabaenaflos-aquae）多种培养基适用于此藻。注意，必须在藻类进入生长停滞期前转接，否则将难以恢复。水华鱼腥藻（Anabaenaflos-aquae）会生长成链状细胞的集合体。根据培养条件的不同，形成的集合体大小形状也不同。进行显微镜下细胞计数或电子颗粒计数仪计数时必须破坏该集合体。为了减小计数差异，取样并进行超声波处理以破坏细胞的链状结构。经超声波处理后，链状细胞链长变短，但是超声时间过长会破坏细胞。各受试组超声的强度和时间应相同。计数足够的视野数（血球计数板，至少400个小格）有利于补偿计数差异。这可以改善显微镜下测量密度的可靠性。可以使用电子颗粒计数仪测量经超声断链处理的总细胞体积。将藻种接种至试验容器中时，采用搅拌或其他类似方法使接种物悬浮。持续振荡（150转/min）或定时剧烈摇动试验容器，以防鱼腥藻聚团。如果已形成团状物，在取样进行测量时应剧烈摇动，以破坏藻团并使藻细胞均匀分布。A.3.3聚球藻（Synechococcusleopoliensis）多种培养基适用于此藻。合适的培养基类型可由提供单位获取。单个杆状细胞。细胞非常小，用显微镜计数很复杂也很困难。使用电子颗粒计数仪时，粒径范围应调至1μm。也可使用体外荧光计进行测量。A.3.4舟形藻（Naviculapelliculosa）多种培养基适用于此藻。合适的培养基类型可由提供单位获取。注意培养基中硅酸盐的量。在某些生长条件下会形成团状物。该藻类细胞有时能够产生脂类，因此在液面可能积聚成膜。基于以上原因，为了获得具有代表性的样品，在取样测量时需采用某些特殊的方法。例如使用漩涡搅拌器剧烈搅动。GB/T21805—XXXX（资料性）培养基B.1OECD藻类培养基OECD藻类培养基同ISO8692中所述培养基，配制方法见表B.1。表B.1OECD藻类培养基NH4ClMgCl2∙6H2OCaCl2∙2H2OMgSO4∙7H2OKH2PO4FeCl3∙6H2OH3BO3MnCl2∙4H2ONa2MoO4∙2H2ONaHCO3Na2SiO3∙9H2O将配制好的储备液经0.2μm滤膜过滤或高压灭菌（120℃,15min），4℃避光冷藏保存。储备液2和储备液4只能通过滤膜过滤灭菌。GB/T21805—XXXXB.2APP藻类培养基APP藻类培养基同ASTM中所述培养基，配制方法见表B.2。表B.2APP藻类培养基NaNO3MgCl2∙6H2OH3BO3MnCl2∙4H2OFeCl3∙6H2ONa2MoO4∙2H2ONa2SeO4∙5H2O bMgSO4∙7H2OK2HPO4NaHCO3--Na2SiO3∙9H2Oab只有硅藻的储备培养时需要。定容用水为去离子水或蒸馏水。使用0.1mol/L或1.0mol/L的NaOH或HCl调节培养基的pH值至7.5±0.1。将配制好的培养基经0.22μm滤膜（使用电子颗粒计数仪进行细胞计数时）或0.45μm滤膜（不使用电子颗粒计数仪进行细胞计数时）过滤灭菌，4℃避光冷藏保存直至用于实验。GB/T21805—XXXXB.3OECD藻类培养基和AAP藻类培养基中各成分的比较表B.3OECD藻类培养基和AAP藻类培养基中各成分的比较NaHCO3NaNO3NH4ClMgCl2∙6H2OCaCl2∙2H2OMgSO4∙7H2OK2HPO4KH2PO4FeCl3∙6H2OH3BO3MnCl2∙4H2ONa2MoO4∙2H2OpHEDTA的摩尔比率略高于单位元素的。这样可以避免离子沉淀，同时使重金属离子的螯合作用最小化。在使用舟形藻（Naviculapelliculosa）作为受试生物时，两种培养基中都需补充Na2SiO3∙9H2O，使其浓度达到1.4mg/L（以Si计）。培养基的pH值是液体中的碳酸盐和空气中CO2的部分压力之间平衡的结果。25℃时的pH值与重碳酸盐的摩尔浓度之间的近似关系见式（B.1）。式中：NaHCO3为15mg/L时，pHeq=7.5（AAP培养基）NaHCO3为50mg/L时，pHeq=8.1（OECD培养基）GB/T21805—XXXXB.4OECD和AAP培养基中各元素的比较表B.4OECD和AAP培养基中各元素的比较CNPKNaGB/T21805—XXXX藻类培养过程示例C.1一般建议根据以下程序培养藻类的目的是为了培养毒性试验所用的藻类。所使用的方法应确保藻类不受细菌污染。无菌培养可能是可取的，但必须建立和使用单藻培养。所有操作必须在无菌条件下进行，以免受到细菌和其他藻类污染。C.2设备和材料C.3培养程序C.3.1准备培养基中所有营养盐都以浓缩储备液形式避光冷藏保存。这些溶液通过过滤或高压灭菌消毒。配制培养基时，将相应量的储备液加到无菌的蒸馏水中。注意不要发生污染。对于固体培养基加0.8％的琼脂即可。C.3.2储备培养储备培养是定期将藻类转接到新鲜培养基中作为初始测试材料的小型藻类培养。如果藻类不经常使用，可以在试管内固体培养基斜面上保存，至少两个月转接一次。用三角瓶进行储备培养时要控制培养基的量（如体积为100ml），若在温度为20℃、连续光照的培养箱中培养，要一个星期转接一次。在大量转接时要用无菌吸管转接到有新鲜培养基三角瓶内。这样，对于生长快速的品种，其初始浓度比原培养物低100倍。可以从生长曲线确定藻类的生长速率。若生长率已知，就可以估计转接到新鲜培养基的密度。培养物必须在到达衰亡期之前转接到新鲜培养基中。C.3.3预培养预培养旨在为试验提供一定量的适合接种测试的藻类培养物。预培养应在与试验要求相同的条件下进行。通常培养2d~4d后藻类仍处于指数生长阶段即可用于试验接种。若镜检发现藻类预培养物被污染或生长异常（如畸形等）应废弃。GB/T21805—XXXX非线性回归数据分析D.1总体思路藻类试验和其他微生物生长试验中的反应——生物量的生长——本质上是一个连续的测量变量。如果使用生长速率，为过程速率；如果使用生物量，则为其随时间的积分。两者都对应于非暴露控制下重复试验的反应均值，反映了所施加条件（光照和温度是藻类试验的主要影响因素）下的最大反应值。试验系统是连续分布的或同质的，可以将生物量视为一个不存在断开的连续统。此类系统中，反应的方差分布只与试验因素有关（通常用误差的对数正态分布或正态分布描述）。与通常以分数表示的生物测量反应变量相反，生物个体的耐受度（通常为二项分布）一般假定为最主要的方差影响因素。控制反应在这里为零或本底水平。在不复杂的情况下，归一化的或相对的反应值，r，将从1（零抑制）单调下降到0（完全抑制）。应注意，所有反应值都有一个误差相伴，明显的负抑制仅是计算的随机误差结果。D.2回归分析D.2.1模型回归分析的目的是以数学回归函数Y=f(C)的形式或更常用的F(Z)的形式（其中Z＝logC）来定量描述浓度反应曲线。用其逆函数C=f-1(Y)计算ECX值，包括EC50、EC10和EC20及其95%的置信限。已经有几个简单的数学函数形式被证明可以在藻类生长抑制试验中成功地描述浓度-效应关系，例如logistic方程、非对称Weibul方程和对数正态分布函数，这些函数都是S形曲线，当C趋近于0时渐进于0，当C趋近于无穷时渐进于1。最近提出的使用连续阈值的函数模型（例如Kooijman的“种群生长抑制”模型，Kooijman等，1996）或可作为渐进模型的替代方法。该模型假设，浓度低于某阈值EC0+时没有影响，其反应值用在起点不可微的简单连续函数浓度轴上截距所对应的反应值来进行估计。应注意，如果方差异质性得到补偿，则可用残差平方和（固定方差假设）或加权平方和的简单最小化来进行分析。D.2.2过程统计过程可概括如下：选择适当的函数方程，Y=f(C)，用非线性回归拟合数据。为了从数据中获得尽可能多的信息，使用每个烧瓶的测量值要优于使用重复测量的均值。但另一方面，实践经验表明，如果测量方差较大，则与使用单个的数据点相比，使用重复测量的均值可以提供更稳健的数学估计，系统误差的影响更小。绘制拟合曲线，检验其是否较好拟合了测量数据，残差分析是拟合效果检查中特别有用的工具。如果所选的浓度反应拟合函数不能很好地描述整个曲线或者曲线中的某些重要部分，例如低浓度时的反应，可选择另外