化学品 生殖发育毒性筛选试验方法 征求意见稿

GB/Txxxxx—XXXX化学品生殖/发育毒性筛选试验方法本文件规定了化学品生殖/发育毒性筛选试验的范围、术语和定义、试验基本原则、试验方法、试验数据和报告。本文件适用于检测化学品的致畸性、繁殖及生长发育毒性筛选。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3.1术语和定义3.1.1雄激素活性androgenicity一种化学物质在哺乳动物体内表现出类似天然雄激素（如睾酮）生理作用的能力。3.1.2抗雄激素活性antioestrogenicity一种化学物质在哺乳动物体内抑制或干扰天然雄激素（如睾酮）作用的能力。通常通过阻断雄激素受体或抑制雄激素的生成来实现其效果。3.1.3抗雌激素活性antioestrogenicity一种化学物质在哺乳动物体内抑制天然雌激素激素（例如雌二醇17β)作用的能力。3.1.4抗甲状腺素活性antithyroidactivity一种化学物质抑制哺乳动物体内天然甲状腺激素（如三碘甲腺原氨酸，T3）的作用的能力，影响新陈代谢及依赖甲状腺激素的其他生理过程。3.1.5繁殖力损害impairmentoffertility雌性或雄性动物生殖功能或能力发生异常。3.1.6生长发育毒性developmentaltoxicity属生殖毒性，系指子代在出生前、围产期和出生以后所表现出的结构（机体缺陷）或功能异常。3.1.7剂量doseGB/Txxxxx—XXXX系指受试物用量，常以受试动物每单位体重每日所给予的受试物的量（mg/kg/day）来表示；在饲料中掺入受试物进行喂养染毒时，也可以用受试物在饲料中的恒定质量分数（mg/kg）来表示。3.1.8用量dosage包括染毒剂量、染毒次数及染毒期限在内的一般性术语。3.1.9明显毒性evidenttoxicity给予受试样品后出现的明确的毒作用表现，可作为危险度评价的充分证据，随着染毒剂量增加，毒性表现可能加重，直至严重中毒或死亡。3.1.10未观察到有害作用的剂量no-observed-adverse-effectlevel（NOAEL）未发现与染毒有关的有害作用的最高剂量。3.1.11雌激素活性Oestrogenicity一种化学物质在哺乳动物体内表现得类似于天然雌激素激素（例如雌二醇17β)的能力。3.1.12生殖毒性Reproductiontoxicity后代的有害影响和/或对男性和女性生殖功能或能力的损害。3.1.13甲状腺素活性Thyroidactivity一种化学物质在哺乳动物体内表现得类似于天然甲状腺激素（如T3）的能力。3.2缩略语3.2.1AGDanogenitaldistance，从肛门到生殖器之间的距离3.2.2PNDPostnatalDay，通常在生物医学和发育生物学中用于描述出生后经过的天数。3.2.3UVCBsChemicalSubstancesofUnknownorVariableComposition,ComplexReactionProductsandBiologicalMaterials，未知成分或有多种组成成分的物质、复杂的反应产物或生物材料。4试验基本原则按照雌、雄两个性别，设多个剂量组给予受试物。从试验开始至处死时，雄性动物的染毒期至少为4周，即交配前期最少染毒2周，交配期和交配后期染毒2周。由于雄性动物交配前期的染毒时间较短，仅以繁殖能力难以全面评估化学品对雄性生殖系统的影响，因此应进行病理组织学检查。交配前期至少染毒2周，和随后交配/生育期至少染毒4周，观察，并对雄性生殖腺进行组织病理学检查，以更全面评价化学品对雄性动物繁殖力和精子形成的毒性作用。雌性动物在整个试验周期内都应进行染毒，交配前期至少染毒2周（相当于两个完整的发情期6GB/Txxxxx—XXXX交配期，妊娠期和分娩后至少13天都应进行染毒，直至处死的当日。适应期和染毒前发情周期评估过后，试验周期的长短取决于雌性动物的状态，通常约63天（交配前至少14天，交配期14天，妊娠期22天，哺乳期约13天）。染毒期间，每日需仔细观察动物的中毒症状。在试验过程中死亡或被处死的动物都要进行大体解剖。实验结束，存活动物也要处死并进行大体解剖。5试验方法5.1动物种属选择本试验方法主要是针对大鼠设计的。如果使用其他种类的动物，需要进行相应的修改。不能使用低生育力或者已知发育缺陷率高的动物品系。要使用健康、未交配和未曾做过试验的动物。应当明确实验动物的种属、品系、性别、体重和年龄。试验初，动物的体重差异应当控制在最小范围，每只动物的体重不能超过同性别平均体重的±20%。如果涉及长期研究或全生命周期研究的初步研究，建议在两项研究中使用来自同一品系和来源的动物。5.2饲养条件实验动物的房间温度要保持在22℃±3℃。除了房间清洗时，房间湿度要至少控制在30%-70%，最好控制在50％-60％。要人工光照，按照12h白天／黑夜循环。动物要用常规饲料饲养，自由饮水。有些受试物可能需要通过与饲料混合来染毒动物，这样就要考虑对动物饲料的选择问题。动物可以单独饲养或者同性别动物分笼群养，每笼不能超过5只动物，饲养笼要适合动物交配。受孕雌鼠要单笼饲养，同时要放入筑巢材料。哺乳期雌鼠与其仔鼠分别单独放置在笼中。饲料应定期进行污染物分析。饮食样本应保留至报告完成。5.3动物准备选择健康、初成年动物，将其随机分为对照组和染毒组。饲养笼要放置有序，最大程度减少由于位置移动可能导致的影响。要对动物逐一标记，在试验开始前至少要在饲养笼中至少适应实验室环境5天。5.4染毒途径和受试物制备除非认为其他染毒方式更合适，否则推荐的受试物染毒途径为经口。当选择经口途径时，通常采用灌胃方法染毒；当然也可以通过饲料或者饮水方法给予受试物。如果需要，受试物需溶解或悬浮在适当的赋形剂中。首先考虑要使用水性溶液／悬浮液，其次考虑油性溶液／乳状液（比如玉米油然后再是其他溶剂的溶液。如果赋形剂不是水，那么就必须要知道其毒性特征。而且要测定受试物在赋形剂中的稳定性。5.5试验程序5.5.1动物的数量和性别各组在试验开始时至少有10只雄性和12-13只雌性。在研究开始之前，评估雌性动物发情周期。如果动物未表现出典型的4-5天发情周期，将不纳入在研究中。因此，建议增加雌性动物的数量，以确保每组有10只雌性。除非出现明显的毒性效应，每组至少应有8只怀孕的雌鼠，这通常是可接受的最低怀孕数量。这样做的目的是为了获得足够的数据，以便正确评估样品对动物的繁殖、妊娠、母鼠和仔鼠行为，以及对子代从受孕到出生后第13天的生长发育的影响。5.5.2剂量设计7GB/Txxxxx—XXXX5.5.2.1通常情况下，每次试验要有至少3个染毒组和1个对照组。染毒剂量水平可依据急性毒性试验或重复染毒试验的结果来设定。对照组动物除了不给予受试物外，其他处理方法与染毒组相同。如果受试物染毒过程中使用了赋形剂，那么对照组就要给予使用的最大体积的赋形剂。5.5.2.2染毒剂量水平的选择应考虑受试样品或相关物质已知的毒性和毒代动力学的数据。还应注意怀孕和非怀孕动物对受试样品敏感性的差异。最高剂量组应可以使亲代动物出现毒性反应，但又不引起动物死亡或明显的损害；下一个剂量水平应选择可以出现与剂量有关的反应，最低剂量组应不引起亲代及其子代动物的任何毒性反应。组间距通常为2-4倍。若设第四个剂量组，剂量组间的组距则可考虑大一些，例如10倍。5.5.2.3在观察到一般毒性（如体重减轻，肝脏、心脏、肺或肾脏的影响等）或其他可能不是毒性反应的变化（如食物摄入减少、肝脏增大）时，应谨慎解读对内分泌敏感终点的观察结果。5.5.3限量试验如果受试样品每天以1000mg/kg的剂量经口给予，或经饲料/饮水给予相当的剂量，仍未观察到任何毒副作用时，则可以采用限量试验，即不必做有多个剂量组的完整试验。若根据结构相关化合物资料预期不会产生毒性，也可采用限量试验。但当人的接触情况表明需要采用较高剂量水平时，则不能进行限量试验。若试验采用的是其他的染毒途径：如吸入或经皮染毒，染毒的最高浓度通常可由受试样品的理化特性来决定。5.5.4染毒5.5.4.1动物要连续染毒，每天1次。当通过灌胃方式染毒时，用胃管或合适插管一次剂量完成。液体受试物一次性灌胃染毒的最大体积取决于实验动物的大小。除了水溶液的灌胃体积可以为1mL/100g,其他性质的溶液不能超过2mL/100g。除了刺激性或腐蚀性受试物需要较高浓度来给予外，一般受试物可通过调节受试物浓度来达到不同染毒剂量的灌胃体积保持一致。5.5.4.2如果受试物是通过饲料或饮水方法来染毒，要确保受试物的添加量不能破坏饲料或饮水中的营养平衡。当受试物通过饲料染毒时，可以采用质量分数（mg/kg）或者根据动物体重使用恒定剂量，使用其他方法必须进行说明。采用灌胃染毒时，动物每天染毒时间要一致，而且要根据动物体重至少按周调节来维持受试物恒定的染毒剂量。5.5.5试验步骤5.5.5.1动物在至少5天适应期结束后，雌、雄动物在开始交配前还要至少染毒2周。试验日程应当安排在动物性成熟后。在不同实验室不同品系的大鼠的性成熟时间会略微不同，比如SD大鼠10周龄、Wistar大鼠12周龄。有后代的母鼠应当在产后第13天或之后不久处死。出生当天（就是当分娩完成时）被定义为出生后0天。没有交配迹象的雌鼠要在交配期最后1天后再过24天～26天才处死。雌鼠和雄鼠在交配期间要持续染毒。雄鼠在交配期结束后要继续染毒，直到完成总计最少28天染毒期。接着雄鼠被处死，如果认为合适，也可以保留并继续染毒用来二次交配。5.5.5.2母鼠在整个怀孕期、直至分娩后13天或处死的前一天都应每天染毒。如吸入或经皮染毒，染毒至少应持续至怀孕的第19天，并且应尽快重新开始给药，不得迟于出生后第4天。试验日程图见附录A。5.5.6动物交配5.5.6.1通常试验中要按照1:1(1雌鼠对1雄鼠）形式进行动物交配。在偶然发生雌鼠死亡情况下除外。一只雌鼠要与同一只雄鼠同笼一直到受孕或者2周时间。每天早上要检查雌鼠阴道中是否有无精子或阴栓。将检查到精子或阴栓的日期被定义为妊娠0天。若交配两周后仍未受孕，可以将不孕雌鼠与同组的其他已证实有生殖能力雄鼠重新交配。8GB/Txxxxx—XXXX5.5.7窝产仔数在出生后的第4天，根据所用鼠品系的正常窝仔数量，通过随机选择淘汰多余幼仔，将每窝的幼仔数量调整为尽可能接近每性别4-5只。从多余的仔鼠中收集两份血液样本，合并后用于测定血清T4水平。根据体重或有肛门生殖距离（AGD）的选择性不合适淘汰仔鼠。当雄性或雌性仔鼠的数量不足以达到每性别有4-5只时，可进行调整（如6只雄性和4只雌性）。当窝产仔数低于淘汰目标（8或10只幼仔/窝则不淘汰任何幼仔。如果只有一只幼仔达到淘汰目标，则只淘汰一只幼仔用于采血以进行T4评估。如果没有调整窝产仔数，在出生后的第4天每窝处死两只仔鼠，并采集血液样本以测量血清甲状腺激素浓度。处死的两只仔鼠应尽可能是雌性，保留雄性幼仔进行乳头评估。当窝产仔数降至每窝8只或10只以下（取决于所用鼠品系的正常窝产仔数）时，将不会淘汰任何幼仔。如果在正常窝产仔数以上只有一个幼仔可用，则只淘汰一只幼仔用于采血以进行T4评估。5.6观察5.6.1临床观察试验期间，每天至少进行一次一般临床观察，如果发现中毒症状，就要增加观察次数。每天的观察时点应固定，并选择在染毒后毒性体征可能出现的高峰期。记录有关的行为改变、难产或滞产症状和所有的毒性反应，包括死亡率。还要记录这些毒性症状出现的时间、程度和持续时间。5.6.2体重和食物消耗量雌鼠和雄鼠在染毒第1天称重，以后每周至少称重1次，试验结束时再称重1次。在妊娠期，雌鼠要分别在妊娠第0天、第7天、第14天和第20天、以及分娩的24h内（产后第0天或第1天）和产后第4天和第13天称重。报告中要有每个成年动物的个体数据。在交配前、妊娠期和哺乳期，要至少按周来测量动物的饲料消耗量。可选择检测动物在交配期的饲料消耗量。当受试物通过饮水方式染毒时，也要测量这些时期动物的水消耗量。5.6.3发情周期为了筛选具有规律发情周期的雌性动物，在开始染毒前监测发情周期。从染毒开始直至出现交配现象，应每天进行阴道涂片。如果担心开始染毒时急性应激反应会改变发情周期，可以让动物暴露两周，每天收集阴道涂片，在交配前至少两周内监测发情周期，并在交配期继续监测，直至出现交配现象。在获取阴道/宫颈细胞时，注意避免粘膜干扰，以防诱导假孕[1][2]。5.6.4仔鼠特征应记录动物的妊娠周期（从受孕0天开始计算）。动物生产后要尽快确定每窝仔鼠中死胎、活胎、低体重鼠（明显小于对照组的仔鼠）的数量和性别，以及是否存在严重畸形。应在分娩后24小时内（产后第0天或第1天）以及至少在产后第4天和第13天对活产仔鼠进行计数和性别鉴定，并对仔鼠进行称重。除了观察亲代动物的行为外，也应记录仔鼠的任何异常行为。应在出生后第0天至4天之间的同一天测量每只仔鼠AGD。在测量AGD当天，应记录仔鼠的体重，并将AGD标准化为衡量仔鼠大小的指标，最好采用体重的立方根[3]。5.6.5临床生物化学根据以下时间采集来自指定部位血液样本：在仔鼠数量允许的情况下，在出生后第4天采集每窝至少两只仔鼠的血样；在第13天终止妊娠时采集所有母鼠以及每胎至少两只仔鼠的血样；9GB/Txxxxx—XXXX在终止妊娠时采集所有成年雄鼠的血样。所有血液样本均在适当条件下储存。对第13天的仔鼠和成年雄鼠的血样进行甲状腺激素（T4）血清水平评估。如果相关，还将进一步评估雌鼠和第4天仔鼠血液样本中的T4含量。如果相关，也可选择测量其他激素。仔鼠的血液可按窝集中起来进行甲状腺激素分析。甲状腺激素（T4和TSH）最好合并收集进行测量。以下因素可能影响激素测定的变异性和绝对浓度：因为激素浓度的昼夜变化，处死的时间可能影响激素测定的变异性和绝对浓度。为了避免过度给动物压力造成应激，处死动物的方法可能会影响激素浓度；用于测定激素的试剂盒可能因标准曲线而有所不同。专门用于测定激素的血浆样本应在一天中的相近时间采集。不同的商用检测试剂盒在分析激素浓度时得出的数值不同。5.6.6病理5.6.6.1大体解剖检查5.6.6.1.1对所有受试的成年动物进行全面系统的大体解剖检查，仔细检查体表、所有体腔开口处、颅腔、胸腔和腹腔及其内部脏器。应重点观察生殖系统的组织和器官，同时记录着床数和黄体数。解剖当天应进行阴道涂片检查，以确定发情周期的阶段，并与雌性生殖器官的组织病理学进行相关性分析。5.6.6.1.2所有成年雄性动物的睾丸和附睾，以及前列腺和精囊腺应适当去除任何附着的组织，并在解剖后尽快测量其湿重，以避免干燥。所有成年动物的卵巢、睾丸、附睾、附属性器官，以及所有呈现肉眼异常的器官，都应予以保存。5.6.6.1.3仔细检查死胎和产后13天处死的仔鼠外观有无畸形。应特别注意外生殖生殖器官，检查是否有发育改变的现象。第13天时，每窝应保留1只雄性和1只雌性仔鼠的甲状腺。应保留所有成年动物的卵巢、睾丸、附属性器官（子宫和宫颈、附睾、前列腺、精囊和凝固腺）、甲状腺和和有肉眼可见损害的器官标本。常规检查睾丸和附睾时避免使用福尔马林固定，建议使用Bouin’s或改良的Davidson方法[4]。可用针在器官的两侧轻轻刺入白膜，使固定剂快速渗透。5.6.6.2组织病理学检查先对高剂量组和对照组动物的卵巢、睾丸、附睾进行详细的组织学检查（特别强调精子发生的阶段和睾丸间质的细胞结构）。如果有必要，也可检查保存的其他组织。在高剂量组发现组织病理学改变时，就要对其他剂量组的动物进行检查[4]。6试验数据和报告6.1数据6.1.1对每只动物的数据，分别进行记录，列表表示试验结果，表中应显示每组的实验动物数、试验中死亡、到期处死的动物数或出于人道原因处死的动物数量、交配的动物数、受孕动物数、各种毒性反应及其出现动物百分数。详细描述观察到的毒性症状，包括出现的时间、持续时间和程度，病理组织学改变和相关的仔鼠资料。附录B中的总结报告表格可以用来记录试验数据。6.1.2受到研究规模的限制，对试验中许多终点，尤其对生殖终点进行的差异性统计分析很难保证其完全准确。选择的统计方法应当适合所研究变量的分布，而且要在试验前就确定统计方法。AGD和乳头保留的统计分析应以仔鼠个体数据为基础。同时考虑窝居的影响。在适当的情况下，以窝为分析单位。仔鼠体重的统计分析也应基于仔鼠的个体数据，并考虑到窝仔数。由于该试验的样本量较小，如果有历史对照数据（如窝产仔数则更有助于解释研究结果。GB/Txxxxx—XXXX6.2结果评价6.2.1试验结果要根据观察到的毒性作用、大体解剖和病理组织学检查结果来评价。评价内容包括研究受试物剂量与畸形出现与消失、发生率和严重程度之间的关系，以及一般损伤、确定靶器官、无生育力、临床畸形、受影响的生殖和产仔功能、体重变化、死亡率和其他毒性效应。6.2.2在评估雄鼠的生殖功能时，由于雄鼠的染毒时间短，因此对睾丸和附睾进行组织病理学检查时，必须结合其生育数据。在可能的情况下，利用生殖/发育的历史对照数据（如产仔数、AGD、乳头评估、血清T4水平）将有助于更好地解释本研究结果。为了确保质量控制，建议收集历史控制数据，并计算数据的变异系数，特别是在与内分泌干扰物检测相关的参数中。6.3试验报告试验报告应尽可能包含以下信息：a)受试物1)来源、批号、使用期限（如果有2)化学品的稳定性（如已知3)单一组分物质；-物理外观、水溶性及其他相关理化性质（例如，酸/碱属性-化学鉴定信息，如IUPAC或CAS名称、CAS号、SMILES或InChI编码、结构式、纯度、杂质的化学成分（如适用且可行）等。4)多组分物质、未知或可变成分物质（UVBC）和混合物：-尽可能通过化学成分（参考上述信息）、各成分的定量含量及相关理化性质进行表征。b)赋形剂（如适用）需要说明使用赋形剂的理由，选用的赋形剂不是水时也应说明理由。c)实验动物1)种类、品系；2)数量调龄、性别（如使用雄性，需说明不选用雌性的理由3)来源、饲养条件、饮食等；4)测试开始时每只动物的体重；5）若选择的物种非啮齿类，应提供合理性说明。d)试验条件1）剂量选择的依据；2）受试样品配比/饲料制备以及应用浓度和稳定性、均匀性的详细资料；3）说明受试物情况；4）按需要，将饲料/饮用水中受试物浓度（ppm）转换成实际剂量[mg/（kg.d）];5）说明饲料和水质量的详细信息。6）详细说明选择仔鼠进行剔除（如果被剔除）的随机程序。e)结果：1）体重/体重变化；2）饲料消耗、水消耗；3）按照性别和剂量划分的毒性反应数据，包括繁殖力、妊娠和其他毒性症状；4）妊娠期长度；5）对生殖、子代、产后生长等的毒性或其他效应；6）临床观察到的现象、严重程度和持续时间（是否可逆7）正常或异常发情周期的成年雌鼠数量和周期持续时间;8）活产数和胚胎植入后丢失数;GB/Txxxxx—XXXX9）仔鼠体重数据；10）所有子代的AGD（以及AGD测量当天的体重）11）雄性仔鼠的乳头评估情况；12）第13天仔鼠及成年雄性（以及母鼠和第4天仔鼠若有测量）的甲状腺激素水平13）有肉眼可见异常的仔鼠数量、外生殖器大体评估、矮鼠数量；14）试验中动物死亡时间或存活至试验结束的动物数；15）着床数、黄体数（推荐）、每窝仔鼠的多少及重量；16）亲代动物被处死时的体重和器官重量的数据；17）解剖结果；18）详细的组织病理学结果；19）吸收胎数据（如可得20）统计学处理结果（如适用）。6.4结果讨论和解释6.5结论GB/Txxxxx—XXXX（规范性附录）生殖/发育毒性筛选试验流程图GB/Txxxxx—XXXX（规范性附录）生殖/发育试验效应汇总报告表观察值用量（单位）对照组剂量1剂量2剂量3...起始配对数（N）发情周期（至少不规则周期的平均长度和频率）有交配迹象的雌性（N）成功怀孕的雌性（N）怀孕第1-5天（N）怀孕第6天（N）怀孕第21天（N）怀孕第22天（N）妊娠第23天（N）有活产仔鼠的母鼠（N）第4天仔鼠存活的母鼠（N）着床/母鼠（均数）出生时活崽数（均数）第4天的活崽数（均数)出生时性别比（m/f均数）第4天性别比（m/f均数）出生时窝重（均数）第4天产仔重（均数）出生体重（均数）测量AGD时体重（雄性平均值，雌性平均值）出生后第4天同日的平均年龄（雄性平均值，雌性平均值，注PND）第4天体重（均数）仔鼠乳头保留第13天（均数）第13天体重（均数）异常的仔鼠一个仔鼠的母鼠数两个仔鼠的母数数三个仔鼠的母鼠数仔鼠的丢失产前/着床后（着床减去