非洲猪瘟病毒一体化分子检测方法征求意见稿

1非洲猪瘟病毒一体化分子检测方法GB/T6682分析实验室用水规格NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范MAOPA（MagneticbeadsmediatedAll-in-OnePolymeraseAmplification）技术，即磁珠介导的一体逐级发生的损耗，具备较强的兼容性，可为各Unigen系统是基于MAOPA技术开发的智能软件、搭配精密硬件的全封闭智能分析系统，采用微流4符号和缩略语PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）2珠全部进入反应体系，实现基于MAOPA技术的一体化分子检测。洗脱和反应，最后从外部对反应液中基因扩增引起的荧光信号变化进行光学检测。与传统的荧光PCR险，为非洲猪瘟病毒的感染早期的精准检测及环境监测提供了技术支6.1.6针对非洲猪瘟病毒P72基因序列设计的特异性引物和探针，并根据随机ASFV检测上游引物ASFV检测下游引物ASFV检测探针6.1.7非洲猪瘟病毒阳性对照样品：培养的灭活病毒，由指定单位提供；或为含有P76.1.9内标样品：含有人工内标基因的重组大肠杆36.1.11无菌去离子水，符合GB7.2Unigen®全封闭智能分析系统样品采集及运输的生物安全措施按《NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》的规定执行；样品处理的生物安全措施按《GB19489实验室生物安全通用要求》的规定执行；基因检测实8.3.2拭子（包括口鼻拭子、血拭子、肛拭子）样品：5000r/min离心2min，8.3.3组织研磨液样品：5000r/min8.3.5血清或血浆样品：无需处理，可直接吸取待4采集或处理好的样品在2℃~8℃保存应不超过24小时；若需长期保存，须放置−70℃以下保存，并9操作步骤9.1扩增反应液的配制将40μmol/LASFV检测上游和9.2检测卡盒的装填裂解液依次灌装至一体化空卡盒对应位置，完成检测卡盒的装填，如附录A.5中图1所9.3一体化分子检测9.3.1加样9.3.2测定打开Unigen®全封闭智能分析系统翻盖，按提示将检测卡盒插入仪器相应的检测通道，按紧。提取伸58°C30秒，共45个扩增循环，阳性对照显示检测结果为阳性，同时FAM通道Ct值≤30并出现典型的扩增曲线，且内标ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线；阴性对照显示检测结果为阴性，同时FAM通道无Ct值且无典型的扩增曲线，且内标ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线，则判为试待检样品FAM通道Ct值＜36并呈现典型的扩增曲线，ROX通道Ct值≤30并呈现待检样品FAM通道无Ct值且无典型的扩增曲线，ROX通道Ct值≤30并呈现典型的5待检样品FAM通道36≤Ct值≤45并呈现典型的扩增曲线，ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线，判为疑似；对疑似样品按原条件进行复检，结果FAM通道Ct值≤45并呈现典型的扩增曲线，ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线，则判为阳性；否则判为6A.1洗涤液Ⅰ称取15.138g三羟甲基氨基甲烷、100g聚乙二醇，加灭菌纯化水定容至1L，混合均匀，0.22μm滤膜A.2洗涤液Ⅱ称取486.59g异硫氰酸胍、26.8g无水乙A.4磁珠用商品化HEPES缓冲液（1mol/L）将商品化磁珠进行10倍A.5检测卡盒装填7