牛羊精液牛羊猪种布鲁氏菌三重 RT-PCR 检测方法与分离培养方法征求意见稿

1牛羊精液牛羊猪种布鲁氏菌三重RT-PCR检测方法与分离培养方法本文件规定了牛羊精液中牛种、羊种和猪种布鲁氏菌三重RT-PCR检测方法和分离培养方法所包括GB/T6682分析实验室用NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4缩略语BHQ：无荧光淬灭基团（Blackholequencher）Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）FAM：6-羧基荧光素（6-caHEX：六氯-6-甲基荧光素（HexachlorofluoresceiPBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline）25.1.40.01mol/LPBS溶液（pH7.4）：按照A.2配制。5.1.7阳性对照：重组质粒，制备过程见附录三重荧光RT-PCR扩增用上、下游引物和探针序列见附6.5冰箱，储藏温度在2℃~8℃和-20℃以下。样品的采集、保存与运输按照NY/T5413上，按顺序加样。8.4荧光RT-PCR反应R9结果判定9.1结果分析条件设定9.2试验成立的条件9.2.39.2.1和9.2.2要求需在同一次试验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。9.3结果描述及判定若被检样品在相应通道Ct值＜38且出现特异性扩增曲线，判为此通道核酸阳性。Cy5通道阳性荧光信号表示内标阳性；ROX通道阳性荧光信号表示牛种核酸阳性；FAM种核酸阳性；HEX通道阳性荧光信号表示猪种核酸阳性。只有一种阳性荧光信号为单4若被检样品在相应通道无Ct值或Ct值＞40，且无特异性扩增曲线，判为相应病原核9.3.3可疑重复试验结果Ct值≤40且有明显扩增曲线则判为相应病原核酸阳性，否则判为相应病原核培养基、双相培养基（青岛海博生物、青岛中创生物公司）、布鲁氏菌可疑鲜精液/冷冻参照血培养法观察结果，15天仍无可疑菌生只含双相培基烧瓶中，轻轻混合倾斜，使被检精液分布在琼脂斜面上，置37℃温箱培养，如果怀疑精液是牛种布鲁氏菌感染时，应有一半标本置CO(下标始)2(下标终)环境中培养，为了提高对布鲁氏菌的检出率和从污染的材料中分离布鲁氏菌，将被检材料(固体标本加灭菌的生5溶液配置A.1DEPC水蒸水中，搅拌至完全溶解后，调pH至7.4，加水定容至1L6利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并按下面公式将浓度换算成拷贝数，DNA拷贝7Brucellaabortus-RROX-TGCCATCCGTGCTGCCATCG-Brucellamelitensis-FBrucellamelitensis-RBrucellamelitensis-PFAM-AGACAGTGCTTCGTCACGCTAGAGCGBrucellasuis-RHEX-CGGCTTAGACCCTACTTATGCGGTG-CY5-TAACCTCGGCACCAGAAGAACAC8荧光RT-PCR反应液配方体积(μL）5×OnestepU+MixBrucellamelitensis-F(10μmol/L)Brucellamelitensis-R(