日本工业标准JISL19022002

PAGEPAGE17日本工业标准JISL1902：2002纺织品抗菌性能的检测与评价Testingforantibacterialactivityandefficacyontextileproducts序纺织品抗菌性能的检测方法始建于1990年。起初作为定性检测的标准，是利用抑菌环来判断抑菌除臭加工过的纺织品的抗菌性能。在1998年的版本中，增加了抗菌加工过纺织品的检测，另外，又增加了菌液吸收法作为定量的检测方法之一。菌转印法作为一种新的定量检测方法添加到本版本中，并据此来评价其抗菌性能。1、适用范围本标准规定了对用抑菌除臭加工和抗菌加工过的纺织品抗菌性能进行评价的试验方法。2、参考标准下述标准虽然是本标准的参考标准，但也是本标准的组成和延续，应用这些标准的大多数较新的版本（含修正版）。JISK0950灭菌塑料平皿JISK0970活塞式微量移液器JISK3800II级生物安全操作台JISK8101乙醇（99.5）JISK8150氯化钠JISK8180盐酸JISK8263琼脂JISK8355乙酸JISK8576氢氧化钠JISK9007磷酸二氢钾JISK9009二水合磷酸二氢钠JISL0803纤维染色牢固度试验标准JISR3505玻璃量器的校准JISZ8401数据修约规则3、检测类型抗菌性能的评价试验可分为以下两类，根据检测目的选择合适的试验方法。定性试验（抑菌环法）本法利用抑菌环来评价经抑菌除臭加工的纺织品的抗菌性能，要求该抑菌除臭剂易于扩散并进入营养琼脂培养基。定量试验菌液吸收法本法利用抑菌或杀菌活性值，来评价较高湿度环境下抗菌、抑菌除臭加工过的纺织制品的抗菌性能。菌转印法本法利用细菌减少值来评价较低湿度下用抗菌加工过的纺织制品的抗菌性能。4、定义本标准涉及的主要术语定义如下：抑菌除臭加工一种用于阻碍、抑制纺织品表面细菌的生长和去除臭味的纺织品加工方法。抗菌加工一种用于扼制或扼杀纺织品表面细菌生长的纺织品加工方法。抑菌环由于纺织品使用的抑菌除臭试剂扩散进入琼脂平板培养基，在细菌培养后，导致样品周围产生透明、不长细菌的部分；该区域就是抑菌环。抗菌活性利用抑菌除臭加工而使制品获得抑制细菌繁殖的能力。抑菌活性值分别在经抑菌除臭加工过和标准对照的纺织制品上接种细菌，经培养后活菌计数，利用两者间活菌数目的对数差值表示抑菌活性值。杀菌活性值分别在经抗菌加工过和标准对照的纺织制品上接种细菌，培养后活菌计数，利用接种的活菌数与培养后抗菌加工制品的活菌数目之间的对数差值来表示杀菌活性值。细菌减少值分别在经抑菌除臭加工和标准对照的纺织制品表面转印上细菌，培养后经活菌计数，利用两者间活菌数目的对数差值表示细菌减少值。抗菌效果抗菌效果就是抑菌除臭加工的抗菌活性，是通过抑菌环、抑菌活性值、杀菌活性值、细菌减少值等来表征。平皿计数法本法是通过10倍梯度稀释法，经培养后对活菌菌落数进行统计的方法。荧光测量法通过定量测定菌液中细菌细胞的ATP（三磷酸腺苷）总含量来换算得到活菌的浓度。5、抗菌效果抗菌效果的评价见下：定性试验（抑菌环法）根据下文步骤9，检测抑菌环的存在与否来评价抗菌效果。定量试验按下述方法来评价抗菌效果。抗菌加工制品的评价可通过杀菌活性值或细菌减少值来表征。菌液吸收法根据下文步骤10.1来检测时，抑菌除臭加工制品的抑菌活性值应≥2.0；抗菌加工制品的杀菌活性值应≥0。菌转印法根据下文步骤10.2来检测时，经抗菌加工制品的细菌减少值应≥0。6、试验用菌6.1、细菌种类可用细菌种类见下：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）大肠杆菌（Escherichiacoli）耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌（MethicillinresistantStaphylococcusaureus）6.2、试验用菌用于试验的细菌应该符合下表1所示。表1、试验用细菌抗菌整理种类细菌种类抑菌除臭加工金黄色葡萄球菌抗菌加工通用型金黄色葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌铜绿假单胞菌*大肠杆菌*特殊用途金黄色葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌*大肠杆菌*注释：1、带*的菌可以省略；2、试验用细菌菌株必须与国际微生物菌株保藏联盟或日本微生物菌株保藏联盟保存的菌株具有相同的系列。7、试验准备7.1、细菌试验的操作条件在进行细菌试验操作前，将两只袖子都挽到胳膊肘附近，用70％～90％（体积比）的酒精或0.1％～1％的倒置肥皂液对双手及胳膊都进行消毒。7.2、药品、材料和器具除特别指定的外，试验所用到的药品、器材见下：酒精：按JISK8101规定的非常纯净或较纯的。倒置的肥皂液：符合日本药典第13次修订版所提到的。琼脂：必须符合JISK8263的规定。牛肉膏：用于微生物试验。蛋白胨：用于微生物试验。氯化钠：必须符合JISK8150的规定。纯水：符合日本药典第13次修订版所提到的。水：符合日本药典第13次修订版所提到的普通水。酵母浸膏：用于微生物试验。胰蛋白胨：用于微生物试验。葡萄糖：用于微生物试验。酪蛋白胨：用于微生物试验。大豆蛋白胨：用于微生物试验。卵磷脂：用于微生物试验。非离子表面活性剂：吐温80。磷酸二氢钾：必须符合JISK9007的规定。二水合磷酸二氢钠：必须符合JISK9009的规定。氢氧化钠：必须符合JISK8576的规定。氯化氢（盐酸）：必须符合JISK8180的规定。乙酸（醋酸）：必须符合JISK8355的规定。三水合（5’三羟甲基氨基甲烷：用于生化试验。二水合四乙酸乙烯基二铵二钠盐：用于生化试验。四水合乙酸镁：用于生化试验。二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol）对映体：用于生化试验。荧光（素）酶（EC编号1.13.12.7）：用于生化试验。D-虫荧光素：用于生化试验。牛血清白蛋白：用于生化试验。蔗糖：用于生化试验。三磷酸腺苷双磷酸酶（EC编号3.6.1.5）：用于生化试验。腺苷脱氨酶（EC编号3.5.1.4）：用于生化试验。10％苯扎氯胺（洁尔灭）水溶液：符合日本药典第13次修订版所提到的。棉塞：使用OME棉塞、硅橡胶塞、金属塞或莫顿（morten）塞。培养皿：用内径为90mm的玻璃制品或符合JISK0950中规定的90A或90B标准。干热灭菌器：能保持在160℃～170℃高压灭菌器：能保持在121℃生物安全柜：符合JISK3800的要求或等同的性能。分光光度计：能在660nm测量。洁净工作台：用于生化试验。铂金接种环：端部大约有4mm左右的圆环。培养箱：能够保温在37℃±1℃小瓶：玻璃制容积30ml，带PP制有内螺纹的盖子，并可加聚四氟乙烯或硅橡胶密封。不锈钢圆片：不锈钢制，直径大约28mm，约20g重。标准织物：100％棉纤维制，着色牢度符合JISL0803的规定，即用洗衣机60℃玻璃棒：直径大约18mm，重约40g～50g。移液管：符合A级或JISK0970、JISR3505标准，或者具有等同的精度。镊子：用于膜滤器的操作。滤膜：由聚碳酸酯制成，直径47mm具有0.4um的微孔。过滤装置：上部有一个带滤膜的漏斗，下面是带抽滤的缓冲瓶。转印装置：能以4N的力拓印到检测样品表面上，并可在3s内旋转180º。荧光光度计：能在300nm～650nm测量，在荧光显色剂作用下分辨精度为10-13mol/l～10-7mol/l的ATP。（具体可参考步骤7.5）试管振荡器：用于微生物试验。PH测量仪：用于微生物试验。注：试管、小瓶、烧瓶、移液管、镊子或其类似物品应仔细用碱性或中性洗涤剂洗涤，然后漂洗干净，烘干，用前必须经高温干热法或高压湿热法灭菌。7.3、灭菌方法7.3.1、干热灭菌将需要灭菌处理的物品放入干热灭菌器中，在160℃～170℃下保持1h～2h，直至棉塞或包装纸注(1)：灭菌后，如果棉塞或包装纸不小心被水弄湿，相关器皿请不要继续使用。7.3.2、高压蒸汽灭菌在高压锅中装上水，把需要灭菌的物体在金属网筐中摆好，放置在高压锅中的架子上。盖紧高压锅，开始加热，在121℃下（压力大约103kPa）保持15min～20min。然后停止加热，自然冷却至温度低于100为保证高压锅的清洁，避免沾染抗菌剂和培养基，必要时可采用中性洗涤剂洗涤，并用大量水冲洗干净。7.3.3、火焰灭菌将物品放入煤气焰或酒精焰中灭菌。若是铂金接种环，应充分灭菌；若是试管，让其接触火焰2s～3s。7.3.4、酒精灭菌将棉花或纱布蘸取75％（体积比）的酒精，轻轻挤压并擦拭需要灭菌的物体。7.4、细菌培养基和生理盐水细菌培养基和生理盐水应按如下的步骤配制和使用。营养琼脂培养基A按如下步骤配制：取5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化钠，15.0g琼脂粉，加到盛有1000ml纯水的烧瓶中，并在沸腾水浴中加热至完全溶解；用0.1mol/l氢氧化钠调节pH至7.0±0.2（25℃下）；塞好棉塞，用高压蒸汽灭菌器灭菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的培养基。若该培养基用于接种细菌时，将此培养基加热至45℃～营养肉汤培养基A按如下步骤配制：取5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化钠，加到盛有1000ml纯水的烧瓶中，混合搅匀后用0.1mol/l氢氧化钠调节pH至7.0±0.2（25℃下）；并分装在试管中，塞好棉塞，置于高压蒸汽灭菌器中灭菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10营养肉汤培养基B按如下步骤配制：取3.0g牛肉膏，5.0g蛋白胨，加到盛有1000ml纯水的烧瓶中，混合搅匀后用0.1mol/l氢氧化钠调节pH至6.8±0.2（25℃下）；若需要就分装在试管中，塞好棉塞，置于高压蒸汽灭菌器中灭菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10营养琼脂培养基B按如下步骤配制：取3.0g牛肉膏，5.0g蛋白胨，15.0g琼脂粉，加到盛有1000ml纯水的烧瓶中，并在沸腾水浴中加热至完全溶解；用0.1mol/l氢氧化钠调节pH至6.8±0.2（25℃下）；塞好棉塞，用高压蒸汽灭菌器灭菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的培养基。当此培养基用于接种细菌时，将此培养基预热至45℃～营养琼脂斜面按如下步骤配制：向试管中加入事前准备好并经预热的营养琼脂培养基A（步骤a）或营养琼脂培养基B（步骤d）约10ml；塞好棉塞，用高压蒸汽灭菌器灭菌。灭菌后，将此试管放入洁净间，并将其相对水平面倾斜15º，至冷却凝固。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃SCDLP培养基按如下步骤配制：取17.0g酪蛋白胨，3.0g大豆蛋白胨，5.0g氯化钠，2.5g磷酸二氢钾，2.5g葡萄糖，1.0g卵磷脂，加到盛有1000ml纯水的烧瓶中；混合搅匀后，加入7.0g非离子表面活性剂；完全溶解后，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至7.0±0.2（25℃下）；若需要就分装在试管中，塞好棉塞，置于高压蒸汽灭菌器中灭菌。若配好后不立即使用，要在5℃～琼脂培养基按如下步骤配制：取20.0g琼脂粉加入到盛有1000ml纯水的烧瓶中；并在沸腾水浴中加热至完全溶解；塞好棉塞，用高压蒸汽灭菌器灭菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃生理盐水按如下步骤配制：取8.5g氯化钠加入到盛有1000ml纯水的烧瓶中；完全溶解；若需要就分装在试管中，塞好棉塞，置于高压蒸汽灭菌器中灭菌。若准备好后不立即使用，要在5℃～10℃洗脱用生理盐水按如下步骤配制：取8.5g氯化钠加入到盛有1000ml纯水的烧瓶中；完全溶解之；再加入2.0g非离子表面活性剂，溶解完后按20ml分装在试管或锥形瓶中，塞好棉塞，置于高压蒸汽灭菌器中灭菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃用于制备ATP标准试剂的SCDLP培养基按如下步骤配制：在洁净工作台中，取10ml的SCDLP培养基（步骤f）到经灭菌处理的试管中，再加入1ml的ATP消除剂（参见7.5d），混匀后在37℃下静置1h，注意防止微生物污染。然后，将其放于70℃～907.5、荧光测量剂，缓冲溶液以及类似试剂荧光测量剂，缓冲溶液以及类似试剂按下述方法配制和使用。ATP标准试剂的储放（2×10-6mol/l）将59.7mg的三水合（5’-）三磷酸腺苷二钠盐溶于盛有100ml纯水的烧瓶中。小心塞好塞子，并将其存放在－20ATP荧光试剂及类似试剂按步骤7.2的规定，荧光光度计所采用的ATP荧光试剂应能够分辨10-13mol/l～10-7mol/l浓度的ATP。其成分和准备步骤见下。ATP荧光试剂的缓冲液分别称取760mg三羟甲基氨基甲烷，370mg二水合四乙酸乙烯基二铵二钠盐，800mg四水合乙酸镁，8mg二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol）对映体，溶于240ml纯水中，并用稀醋酸把pH调节为7.5±0.2（25℃ATP荧光试剂分别称取10mg荧光（素）酶，15mgD-虫荧光素，60mg牛血清白蛋白溶于30mlATP荧光试剂的缓冲液中（步骤1制备）。溶解完全后在室温下静置15min后使用。注意配好的ATP荧光试剂必须在3h内使用。ATP萃取剂能从接种用的试验菌细胞中萃取ATP，效率不低于80％。其成分和准备步骤见下文举例。用纯水将10％的苯扎氯胺（洁尔灭）水溶液稀释10倍。ATP消除剂在营养肉汤培养基B（步骤7.4c）中加入1/10的本试剂，可将培养基中的ATP在15min内降低到低于10-13mol/l的水平。其成分和准备步骤见下：在10ml含有0.037％蔗糖、0.005mol/l的磷酸二氢钠缓冲溶液中（pH＝7.2±0.2，25℃接种准备的缓冲液该缓冲液含有0.037％蔗糖、0.005mol/l的磷酸二氢钠（pH＝7.2±0.2，25℃7.6、细菌的转接与保存细菌的转接应在无菌条件下按下述步骤进行。一只手拿一贮藏菌株的试管和一斜面培养基试管（步骤7.4e）（对于定性试验，用营养琼脂培养基A；对于定量试验，用营养琼脂培养基B），另一只手握住铂金接种环的茎部，取下试管的棉塞，并在火焰上对试管口进行灭菌。然后将铂金接种环用火焰灭菌并将其插入斜面培养基中有冷凝水的地方(2)，冷却后用其从贮藏菌株的试管中刮一环培养基表面的细菌，接种并分散(3)到新鲜的斜面培养基表面，再次用火焰对试管口灭菌，并塞好塞子。对用过的铂金接种环再次进行火焰灭菌。转接好细菌的斜面培养基在37℃±1℃下培养24h～48h，并在5℃一个月内应按上文的步骤再次进行转接，但转接的代数应控制在10代以内；若转接的斜面保存超过一个月，则不得用于下次的转接。注(2)：参见图1。注(3)：如图1所示，用冷凝水分散细菌，并沿斜面画一直线直至端部。再次用接种环打散细菌，然后插入冷凝水中，再画一条Z形折线直至端部。参考资料：为长期贮藏细菌，需采用冻干管或经转接培养后，培养基上部用灭菌石蜡封好。图1、在斜面培养基上转接细菌8、试验用接种液的培养和制备以及活菌计数8.1、试验用接种液的培养和制备8.1.1、试验用接种液的培养按以下步骤进行细菌接种的培养。菌培养物A用铂金接种环从保藏菌株（符合步骤7.6）上刮一环转接到斜面培养基（步骤7.4e）上，然后在37℃±1℃菌培养物B从培养好的斜面上（步骤a）刮一环转接到营养肉汤培养基A（步骤7.4b）上，并在37℃±1℃下培养活化24h±菌培养物C用铂金接种环从保藏菌株（符合步骤7.6）上刮一环转接到含有营养琼脂培养基B（步骤7.4d）的平皿上，在37℃±1℃下培养24h～48h。然后将此平皿在5℃～10菌培养物D取20ml的营养肉汤培养基B（步骤7.4c）到100ml锥形瓶中，再用铂金接种环从菌培养物C的平皿上刮一菌落的细菌接种到肉汤中，并开始活化培养(4)。注(4)：活化培养条件见下温度：37℃±1振荡转速：110转/分，振幅3cm培养时间：18h～24h菌培养物E取20ml的营养肉汤培养基B（步骤7.4c）到100ml锥形瓶中，加入菌培养物D得到的细菌液0.4ml，菌液浓度为（1～2）×108cfu/ml，并开始培养(5)。注(5)：接种培养条件见下温度：37℃±1振荡转速：110转/分，振幅3cm培养时间：3h±1h培养后菌液浓度：约107cfu/ml参考资料：该活化好的菌液在冰点保存条件下，可在8h内使用。8.1.2、试验用接种液的制备定性试验的接种（抑菌环法）通过吸光度法(6)或荧光光谱法(7)来确定菌培养物B中的细菌浓度，并在室温下用营养肉汤培养基A（步骤7.4b）稀释至（106～107）cfu/ml。定量试验的接种（菌液吸收法）通过吸光度法(6)或荧光光谱法(7)来确定菌培养物D中的细菌浓度，并在室温下用营养肉汤培养基B（步骤7.4c）稀释至（1～2）×108cfu/ml。然后，通过吸光度法(8)或荧光光谱法(9)来确定菌培养物E中的细菌浓度。用纯水将营养肉汤培养基B（步骤7.4c）稀释20倍，并在冰浴下用稀释液将菌培养物E得到的菌浓度稀释至（1±0.3）×105cfu/ml，用于接种试验。该接种试验菌液在0℃注(6)：吸光度法步骤见下。取1ml步骤8.1.2a掌握光吸收度与细菌浓度的关系曲线。注(7)：荧光光谱法步骤见下。绘制标准曲线，计算回归公式。1）用纯水稀释步骤7.5a）得到的ATP标准试剂分别至2×10-8mol/l，2×10-9mol/l，2×10-10mol/l，并置于塑料试管中。2）分别取稀释后的ATP标准试剂2×10-8mol/l，2×10-9mol/l，2×10-10mol/l各0.1ml于塑料试管中，加入步骤7.5e得到的缓冲溶液0.9ml，并充分振荡。分别取上述浓度的溶液各0.1ml于塑料试管中，以其作样品测量稀释后的标准ATP试剂。3）加入0.1ml纯水，0.8ml接种缓冲液，0.1mlATP消除剂到塑料试管中，充分振荡后，取3支塑料试管分别加入0.1ml上述溶液，静置5min～30min，作为测量空白使用。4）加入0.1mlATP萃取剂到步骤3）得到的测量空白中，摇匀后加入0.1ml的ATP荧光试剂，用旋涡振荡器分散5s后，立即用荧光光度计测量发光度。5）取0.1mlATP萃取剂分别加入到用来测量稀释后标准ATP试剂的样品（步骤2）中，按浓度升序的次序加入；摇匀，然后加入0.1mlATP荧光试剂，用旋涡振荡器分散5s后，立即用荧光光度计测量发光度。6）通过测量稀释后标准ATP试剂（浓度为1×10-8mol/l，2×10-9mol/l，2×10-10mol/l）的发光度的平均值来除以ATP浓度，可得到平均值的系数A。系数B可以通过下式（1）在Y＝0时得到。校准曲线表达式Y＝AX＋B………………（1）其中，Y：ATP浓度（mol/l）X：发光度（RLU=RelativeLightUnit为相关光量）接种的ATP浓度按下述步骤测量。1）准备1支ATP消除试验用试管和3支测试用试管。2）为评价ATP消除效果，取0.1ml步骤8.1.2a3）取0.1ml的ATP萃取剂到步骤2）中的测试用试管中，振荡5s；然后再加入0.1ml的ATP荧光试剂，用旋涡振荡器分散5s后，立即用荧光光度计测量发光度。4）得到ATP浓度Y，根据式（1）并结合下式（2）将ATP浓度转化为细菌浓度。P＝10×Y×10-3/Q…………………（2）其中，P：细菌浓度（cfu/ml）Q：每种细菌细胞的ATP总量（mol/cell），具体数据见下金黄色葡萄球菌：2.4×10-18mol/cell肺炎克雷伯氏菌：1.7×10-18mol/cell耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌：9.6×10-19mol/cell铜绿假单胞菌：8.6×10-19mol/cell大肠杆菌：2.4×10-18mol/cell10：稀释倍率10-3：升到毫升的转换系数注(8)：菌液吸收法说明见下。充分振荡菌培养物E得到的接种液，用纯水稀释5倍，然后用旋涡振荡器分散均匀；静置30s后，用分光光度计在660nm处测量吸收度。注(9)：荧光测量法按注(7)步骤测量；但Q值按下面数据处理。Q：每种细菌细胞的ATP总量（mol/cell），具体数据见下金黄色葡萄球菌：9.5×10-18mol/cell肺炎克雷伯氏菌：4.7×10-17mol/cell耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌：3.5×10-18mol/cell铜绿假单胞菌：9.8×10-17mol/cell大肠杆菌：2.8×10-16mol/cell定量试验的接种（菌转印法）假定菌培养物D中接种用的细菌浓度和菌培养物E中接种用的细菌浓度与步骤8.1.2b）中是相同的。用纯水稀释营养肉汤培养基B（步骤7.4c）20倍，在冰浴中用稀释的营养肉汤调整菌培养物E，得到接种用菌液，使其细菌浓度达到（1～2）×107cfu/ml，制成试验用接种液。该试验用接种液应在冰浴下存放并在4h内使用。8.2、活菌计数法通过10倍梯度稀释倾注平板培养基的方法或通过荧光测量法来测定洗脱后菌液中细菌浓度。8.2.1、倾注培养基法倾注培养基法是通过10倍梯度稀释法来测定的，按下述步骤操作。用灭过菌的移液管取1ml来自步骤10.1.3c）、步骤10.1.3d）、步骤10.2.4d）、步骤10.2.4e）洗脱后的菌液，加入到盛有9ml±0.1ml生理盐水（步骤7.4h）的试管中，充分振荡。用移液管取1ml上述混匀的菌液，加到另一支盛有9ml±0.1ml生理盐水（步骤7.4h）的试管中，并振荡均匀。重复上述操作，用10倍梯度稀释法制备好一系列浓度，用移液管从系列梯度稀释的试管中连续取1ml，分别放于2个平皿中，然后各加入预热至45℃～46℃的营养琼脂培养基B（步骤7.4d）15ml，盖好上盖，室温静置15min。培养基固化后，将平皿倒转，在37P＝Z×R……………………（3）其中，P：细菌浓度（cfu/ml）Z：平行试验的两个平皿计数的平均值（菌落数）R：稀释比例（倍数）8.2.2、荧光光谱法荧光光谱法按以下步骤操作。确定校准曲线表达式。稀释ATP标准试剂（步骤7.5a）到2×10-8mol/l，2×10-9mol/l，2×10-10mol/l至塑料试管中。若采用接种菌液吸收法则用（步骤7.4i）的洗脱用生理盐水来稀释；若采用菌转印法则用（步骤7.4j）的用于制备ATP标准试剂的SCDLP培养基来稀释。分别取2×10-8mol/l，2×10-9mol/l，2×10-10mol/l的ATP标准试剂0.1ml到塑料试管中，加入0.9ml的缓冲溶液（步骤7.5e），充分振荡。取0.1ml上述溶液到3支塑料试管中作为样品测量稀释后的标准ATP试剂。对于接种菌液吸收法取0.1ml洗脱用生理盐水（步骤7.4i），或者对于菌转印法则取0.1ml（步骤7.4j）的用于制备ATP标准试剂的SCDLP培养基；0.8ml的缓冲溶液（步骤7.5e），0.1ml的ATP消除剂置于塑料试管中，混匀后各取0.1ml溶液到3支塑料试管中，静置5min～30min后作为测试用空白样品。在步骤3）的空白样品试管中加入0.1ml的ATP萃取剂，混匀后加入0.1mlATP荧光试剂，用旋涡振荡器分散5s后，立即用荧光光度计测量发光度。按浓度的升序在步骤2）用于测量稀释后标准ATP试剂的样品中各加入0.1ml的ATP萃取剂，振荡5s后，加入0.1ml的ATP荧光试剂，用旋涡振荡器分散5s后，立即用荧光光度计测量发光度。用不同浓度ATP标准试剂的发光度的平均值除以ATP浓度，得到平均值的系数A。系数B可以通过式（1）在Y＝0时得到。测定洗脱液中的ATP浓度。每组试验均需准备ATP消除效果试验用试管1支，测量试验用试管3支。取步骤10.1.3c）、10.1.3d）、10.取0.1ml的ATP萃取剂到步骤2）中的测量用试管中，振荡5s后，加入0.1mlATP荧光试剂，用旋涡振荡器分散5s后，立即用荧光光度计测量发光度。.根据式（1）得到ATP浓度Y。根据式（2）和下面的Q值可得到细菌浓度值。菌液吸收法中的Q值：金黄色葡萄球菌：2.4×10-18mol/cell肺炎克雷伯氏菌：1.7×10-18mol/cell耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌：9.6×10-19mol/cell铜绿假单胞菌：8.6×10-19mol/cell大肠杆菌：2.4×10-18mol/cell菌转印法中的Q值：金黄色葡萄球菌：9.5×10-18mol/cell肺炎克雷伯氏菌：4.7×10-18mol/cell耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌：3.5×10-18mol/cell铜绿假单胞菌：9.8×10-17mol/cell大肠杆菌：2.8×10-18mol/cell9、定性试验（抑菌环法）9.1、试验样片的制备9.1.1、试样的大小、形状和数量试验用样品的大小、形状参见下表2。对每种测试细菌，各准备3片经抑菌除臭加工的样品和3片标准布样品。表2、试验用样品的大小和形状试样种类试验用样品的大小和形状机织织物、针织织物、非机织织物直径28mm圆形(10)。纱线如图2所示，在一块38mm×26mm载玻片的中间单层缠绕28mm宽的纱线（约3.3g）(11)。纤维填料、长绒取大约0.2g，裁成3mm～5mm，混合均匀，放在如图3所示的内径为28mm的圆筒中，均匀铺开，施加压力使之形成28mm直径的圆形(12)。注(10)：织物样品也可以是28mm×28mm的正方形。(11)：如图4所示，取大约0.2g重5cm长的纱线，成束平行放置，分别在离两端约5mm处用相同的纱线绑住（成捆包状）。也可用这种样品。(12)：裁好后用大约63.7MPa的压强保持10min，模压后可以使用。单位：mm图2、试样在载玻片上的缠绕图3、制备试样用容器图4、捆包状测试样9.1.2、试样预处理对于用铝箔包好步骤9.1.1中得到缠绕的试样或放在培养皿中的样品，放置在高压蒸汽灭菌器中灭菌。若纱线试样经过抗菌整理并缠绕在载玻片上，则本步骤可以省略。9.2、试验操作9.2.1、倾注平板培养基的制备在洁净工作台中，取1ml步骤8.1.2a）中的菌液到经灭菌处理的平皿中，加入15ml预热至45℃～46℃的营养琼脂培养基A（步骤7.4a），充分混合，室温静置直至固化。将平皿翻转(13)，保持上盖倾斜注(13)：见图5(14)：见图6图5图69.2.2、试样的试验操作用无菌纱布蘸酒精对镊子进行消毒，小心取经步骤9.1.2处理的试样放置于步骤9.2.1制备的平板培养基的中心，使样品紧贴在培养基表面并注意不要擦坏表面。在此过程中若样品在处理时容易卷曲或具有纤维填料、长绒等，可在试样(15)上面放置一经过灭菌处理的不锈钢圆片。注(15)：若不锈钢圆片比试样大，可将该圆片放置到几个堆砌起来的试样上，保证不锈钢圆片不会接触到培养基表面。9.3、培养试验将步骤9.2.2得到的平皿倒置(16)，在37℃±1注(16)：当试验样品上放有不锈钢圆片或样品缠绕在载玻片上时，平皿不需翻转。9.4、确定试验用菌的活性状况按步骤9.3培养完后，若标准布所在的培养基表面没有显著的细菌增殖，则该试验无效，应重复本试验。9.5、试验结果9.5.1、抑菌环的测量在按步骤9.3培养完成后，从平皿底部看在试验样品周围有抑菌环出现；如下图7所示测量T值和D值，以mm为单位的整数；根据下式（4）来计算抑菌环宽度。这样可以得到抗菌样品的3个片的抑菌环宽度平均值，注意保留一位小数。W＝（T－D）/2……………………（4）其中，W：抑菌环宽度（mm）T：试样和抑菌环的总宽度（mm）D：试样的长度（mm）图7、抑菌环的测量9.5.2、抑菌环存在的评价根据表3来对步骤9.5.1的抑菌环结果进行评价。表3试验结果抑菌环存在的判定抑菌环宽度平均值＞0存在抑菌环宽度平均值＝0不存在9.5.3、试验结果的记录记录细菌名称、保藏号、接种细菌浓度、抗菌处理样品的抑菌环宽度平均值、是否存在抑菌环、试验样品的形状和种类等。若在样品上放置了不锈钢圆片，在试验结果记录中应该标明（参考下面的示例）。示例：检测结果试验细菌名称（保藏号）金黄色葡萄球菌（ATCC6538P）肺炎克雷伯氏菌（ATCC4352）细菌浓度（cfu/ml）2.3×1063.5×106抑菌环平均宽度（mm）3.52.0抑菌环存在的判定存在存在样品种类、形状等描述针织织物，直径28mm的圆形（用不锈钢圆片盖压）10、定量试验10.1、菌液吸收法10.1.1、试验样片的准备制备6片标准布样片(17)和3片经抑菌除臭加工的样片，重约0.4g尺寸在18mm的正方形。制作样片时注意避免污染。注(17)：在6片标准布样片中，3片用作接种后立刻进行活菌计数，剩下3片用作培养试验后的活菌计数。10.1.2、样片的灭菌取步骤10.1.1中得到的每片样品(18)~(21)分别放到小瓶中。将去盖小瓶按口朝上放入金属筐中，筐上部加以铝箔封装，瓶盖也单独用铝箔封包，并用高压锅灭菌。灭菌完毕后，立即从高压锅取出，去掉铝箔，置于洁净工作台上干燥60min，然后旋紧小瓶盖子。注(18)：若试样容易卷曲，按方形取0.4g，对折得到约18mm的正方形，将其放于小瓶中，上面压一只玻璃棒，或者折叠成18mm的正方形，重约0.4g的样片，并用线固定一端或两端。注(19)：若是羽毛或纤维填料的试样，取0.4g放于小瓶中，并放一个玻璃棒在上面。注(20)：对于纱线样品，取若干束成捆，并压一只玻璃棒在上面。注(21)：若是地毯或者类似物，叠起来裁，取0.4g重的一叠放入小瓶中，其上压一只玻璃棒。10.1.3、试验操作接种试验的培养用移液管准确量取0.2ml步骤8.1.2b）中制备的试验用接种液，按点样接种(22)到步骤10.1.2准备的样品上，并盖紧瓶盖。注(22)：为充分浸透样品，可在接种液中加入0.05％的非离子表面活性剂。若接种液中加入了表面活性剂，则在检测结果和报告中要如实记录。培养试验接种后开始培养试验（3个标准布对照样，3个经抑菌除臭加工的试样），在温度为37℃±1℃下培养18h±接种完成后立即洗脱取20ml洗脱用生理盐水（步骤7.4i制备）加入到步骤a）中3个标准布对照样的瓶中，旋紧瓶盖，用力振荡（振幅30cm振荡30次）或用旋涡振荡器（每次5s振荡5次）来洗脱每个试样表面的细菌。培养完成后的洗脱各取20ml冰冷的生理盐水（步骤7.4i制备）分别加入到步骤b）中的6个样片的小瓶中，旋紧瓶盖，用力振荡（振幅30cm振荡30次）或用旋涡振荡器（每次5s振荡5次）来洗脱每个试样表面的细菌。活菌计数结合步骤8.2并根据式（5）得到活菌浓度。M＝P×20………（5）其中，M：活菌数目（cell）P：按步骤8.2得到的细菌浓度（cells/ml）20：洗脱用生理盐水的体积（ml）10.1.4、检测结果试验有效性的判定根据细菌增殖数量来判定试验结果的有效性。按式（6）得到细菌增殖数量，并按JISZ8401的标准修约成两位有效数字。若增长值大于1.5，则试验有效；若增长值小于或等于1.5，则试验结果无效。若试验结果无效，需要重复试验。F＝Mb－Ma……………………（6）其中，F：细菌增长值Mb：3个标准对照布样品经18h培养试验后得到活菌数目的常用对数之平均值。Ma：3个标准对照布样品在接种后立即洗脱得到活菌数目的常用对数之平均值。活性值的计算若试验有效，根据式（7）可得到抑菌活性值；根据式（8）可得到杀菌活性值；注意只保留2位有效数字。S＝Mb－Mc……………………（7）L＝Ma－Mc……………………（8）其中，S：抑菌活性值L：杀菌活性值Ma：3个标准对照布样品在接种后立即洗脱得到活菌数目的常用对数之平均值。Mb：3个标准对照布样品经18h培养试验后得到活菌数目的常用对数之平均值。Mc：3个经抑菌除臭加工的样品在18h培养试验后得到活菌数目的常用对数之平均值。试验结果的记录记录细菌名称、保藏号、接种细菌浓度、抑菌或杀菌活性值、活菌计数方法、试验样品的种类等（参考下面的示例）。若在接种菌液中加入了非离子表面活性剂，要记录其名称和浓度。

示例1、试验结果（抑菌活性值）试验细菌名称（保藏号）金黄色葡萄球菌（ATCC6538P）肺炎克雷伯氏菌（ATCC4352）细菌浓度（cfu/ml）1.2×1051.1×105细菌增长值（F）2.73.2抑菌活性值（S）2.32.5活菌计数方法平板计数法样品的种类材料短袜100％纯棉示例2、试验结果（杀菌活性值）试验细菌名称（保藏号）金黄色葡萄球菌（ATCC6538P）肺炎克雷伯氏菌（ATCC4352）细菌浓度（cfu/ml）1.0×1050.9×105细菌增长值（F）2.73.1杀菌活性值（L）1.51.2活菌计数方法荧光光谱法样品的种类材料窗帘100％聚酯接种试验用非离子表面活性剂的种类浓度聚氧乙烯山梨醇单油酸酯0.05％10.2、菌转印法10.2.1、试验用样品制备每片60mm见方的试样，共6片标准布样片(23)和3片抗菌加工的样品。制作样片时注意避免污染。注(23)：在6片标准布样片中，3片用作转印接种后立刻进行活菌计数，剩下3片用作培养试验后的活菌计数。10.2.2、样片的灭菌