槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定

PAGEPAGE2槐米中芦丁的提取,分离与鉴定实验报告槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定槐米为豆科植物槐（SophorajaponicaL．）的未开放花蕾。味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。槐米常炒炭应用。槐米的主要化学成分为芦丁，其含量可达12～16％，其次含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。芦丁具有Vitp样作用，可降低毛细血管脆性和调节通透性。临床上用作毛细血管脆性引起的出血症，常作为高血压症的辅助治疗药。[目的要求]1．通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。2．掌握槲皮素的制备原理及操作。3．熟悉紫外光谱在黄酮结构鉴定中的应用4．通过芦丁的结构检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。[实验原理]芦丁（rutin）：C27H30O16·3H2O，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。槲皮素（quercetin）：C15H10O7·2H2O，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。+鼠李糖+葡萄糖+鼠李糖+葡萄糖芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。芦丁可被稀酸水解生成槲皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此进行制备槲皮素。通过纸色谱及紫外光谱进行黄酮及糖的鉴定。[实验内容]一、芦丁的提取分离及精制方法⑴槐米粗粉（50g）置1000ml烧杯中，加入500ml饱和石灰水，加热，并维持pH8～9煮沸20分钟，趁热用脱脂棉滤过滤液药渣用300ml饱和石灰水煮沸10分钟，维持pH8～9趁热滤过滤液药渣（×）合并在60℃～70℃下用浓HCl调pH至4 ～5静置，抽滤沉淀低温（80℃）干燥，称重。按1：200的比例加水，加热使溶解，趁热滤过滤液静置，抽滤，减压干燥，计算收率芦丁精制品方法⑵利用芦丁在冷热溶剂中的溶解度不同进行提取分离。槐米粗粉沸水煮沸5～10分钟，反复2次趁热滤过水提取液药渣放冷沉淀析出（粗芦丁）热水重结晶或乙醇重结晶芦丁结晶二、槲皮素的制备称取精品芦丁1g置250ml烧瓶中加2%H2SO4200ml加热回流1小时放冷，静置，抽滤酸性滤液沉淀中和水洗两次，干燥乙醇重结晶中性滤液称重，计算收率浓缩黄色细针状结晶浓缩液（槲皮素）（供糖的PC鉴定）三、检识反应1．芦丁的定性反应取芦丁适量，加乙醇使溶解，分成三份供下述试验用：(1)盐酸镁粉试验：取样品液适量，加2滴浓HCl、再酌加少许镁粉，即产生剧烈的反应，并逐渐出现红色至深红色。(2)锆-枸试验：取样品液适量，然后加2％ZrOCl2的甲醇溶液，注意观察颜色变化，再加入2％枸椽酸的甲醇溶液，并详细记录颜色变化。(3)α-萘酚-浓硫酸反应：取样品液适量，加等体积的l0％α-萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁缓加浓硫酸，注意观察两液界面的颜色。2．芦丁的UV(1)鉴定试剂的配制①甲醇钠溶液：取0.25g金属钠，切碎，小心加入色谱甲醇10ml中，此液置于玻璃瓶中，用橡皮塞密封。②三氯化铝溶液：取1g无水三氯化铝，小心加入色谱甲醇20ml中，放置24小时后全部溶解即得。③醋酸钠：用无水粉末醋酸钠。④⑤硼酸饱和溶液：取无水硼酸，加入适量色谱甲醇、制成饱和溶液。（上述贮备液可放置六个月）（2）芦丁溶液的配制精密称取芦丁纯品0.5g，用甲醇适量溶解至50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。（3）光谱的测定①甲醇光谱：取样品液置石英杯中，至200～500nm内进行扫描，重复一次，观察紫外光谱。②甲醇钠光谱：取样品液置石英杯中，加入甲醇钠溶液3滴后，立即测定，放置5分钟后再测一次。③三氯化铝光谱，在盛有样品液的石英杯中，加入三氯化铝6滴，放置1分钟后进行测定。测定后加入3滴盐酸溶液（盐酸：水＝1：1）再进行测定。④醋酸钠光谱：取样品液约3ml，加入过量的无水醋酸钠固体，摇匀（杯底剩有约2mg的醋酸钠），加入醋酸钠后两分钟内测定，5分钟到10分钟后再测定一次。3．芦丁及槲皮素的色谱支持剂：中速层析滤液（5×20cm）展开剂：正丁醇-醋酸-水（4：1：5）上层样品：自制槲皮素的乙醇溶液自制芦丁的乙醇溶液对照品：槲皮素标准品的乙醇溶液芦丁标准品的乙醇溶液显色剂：三氯化铝乙醇溶液喷雾4．糖的纸色谱检识支持剂：中速层析滤纸（5×20cm）样品：取水解后的滤液10ml，水浴加热，且在搅拌下加适量碳酸钡细粉至PH中性，过滤，取滤液并浓缩至2mI左右，放冷后，供纸色谱点样用。对照品：1％葡萄糖标准品醇溶液及1％鼠李糖标准品醇溶液展开剂：正丁醇-醋酸-水（4：1：5）上层显色剂：喷以邻苯二甲酸苯胺溶液，105℃烘烤5分钟至斑点显色清晰。[实验说明及注意事项]1．用石灰水调节芦丁提取溶液的PH，既可以达到碱提取芦丁的目的，还可以除去槐米中含有的大量粘液质。但钙离子浓度及pH值均不宜过高，否则多余的钙能与芦丁形成螯合物沉淀，同时黄酮母核在强碱性条件下易被破坏。2．用HCl调PH时，应注意PH不要过低，因为PH过低（PH2以下）会使芦丁形成盐而使已形成的沉淀重新溶解，同时黄酮母核也会在强碱性条件下被破坏，导致收率下降。．注意观察槲皮素制备过程中的实验现象。[思考题]1．苷类结构检识的一般程序？2．苷类水解有几种催化方法？3．怎样确定芦丁结构中糖基是否联结在槲皮素3-O位上？4．怎样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖及一个鼠李糖？5．UV在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。实验一槐米中芦丁的提取、分离与鉴别一、实验目的（1）掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。（2）掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。二、实验原理芦丁(Rutin)亦称芸香苷(Rutisude)，广泛存在于植物界中。现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。槐花米为豆科植物槐(SophorajaponicaL)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达23.5%，槐花开放后降至13.0%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性，临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。芦丁(Rutin)为淡黄色细小针状结晶，mp.174℃~178℃(含三分子结晶)，188℃(无水物)。溶解度情况如下：水：1:10000(冷)，1:200(热)甲醇：1:100(冷)，1:9(热)乙醇：1:300(冷)，1:30(热)吡啶：1:11.7(冷)，易溶(热)不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。芦丁可溶于热水，难溶于冷水，其分子结构中具有较多的酚羟基，显弱酸性，在碱液中易溶解，而在酸性条件下，易析出沉淀，故本实验采用碱溶解酸沉淀的方法自槐米中提取芦丁。再利用其在冷热水中溶解度的差别采用沸水为结晶溶剂进行精制。利用芦丁可被稀酸水解，生成苷元和糖，通过颜色反应、薄层层析等方法进行检识和确认芦丁。三、实验内容（一）芦丁(芸香苷)的提取1.取1.5g石灰粉（CaO），置于干净的小研钵中，加入10mL水研成乳液备用。称取槐米20g，于1000m1烧杯中，加0.4%硼砂水溶液200mL，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH8～9，加热至微沸，维持pH值20-30分钟，趁热抽滤，弃去滤渣，冷至60-70℃用浓盐酸调至pH4-5，放置过夜，减压过滤，得粗芦丁（滤饼用水洗3-4次），干燥后得粗品。（二）芦丁(芸香苷)的精制1.将芦丁粗品置烧杯中，按(1：200)加蒸馏水，加热煮沸数分钟，使其充分溶解，趁热抽滤，滤液放置过夜；2.减压过滤，用少量蒸馏水洗涤沉淀2-3次，抽干，即得芦丁精品。（三）鉴别（1）莫氏(Molish)反应取芦丁数毫克，置于小试管中，加2ml乙醇溶解，再加10%α-萘酚乙醇液1ml，振摇使之溶解，然后沿试管壁加浓硫酸约2ml，静置，观察，两液层界面变化，呈紫红色环者示分子中含糖结构。(2).盐酸镁粉反应 取芦丁数毫克，置于小试管中，加2ml乙醇热溶，加镁粉少许，滴加浓盐酸，溶液由黄色逐渐变红者示有黄酮类化合物存在。(3).醋酸镁纸片反应取一张滤纸，滴两滴芦丁的乙醇溶液，然后加1%醋酸镁甲醇溶液两滴，黄酮类应呈黄色荧光。紫外灯下观察荧光的变化，并记录现象。(4).三氯化铝纸片反应取一张滤纸，分别滴两滴芦丁的乙醇溶液，然后加1%三氯化铝甲醇溶液两滴，黄酮类化合物应呈鲜黄色。紫外灯下观察荧光的变化，并记录现象。实验操作要点硼砂的作用。芦丁分子因含有邻二酚羟基，性质不太稳定，暴露空气中，在光的作用下，能缓缓分解，变为暗褐色，在碱性条件下更容易被氧化分解，硼酸盐能与邻二酚羟基结合，达到保护的目的。因此，加入硼砂既能调节碱性水溶液的pH，又能保护芦丁减少氧化。加入石灰乳使pH8～9，既可达到溶解芦丁的目的，又可以出去槐米中含有的大量多糖、粘液质，但pH不能过高，否则钙能与芦丁形成螯合物而析出沉淀。用浓盐酸调pH4～5，pH过低，会使芦丁生成盐而降低收率。思考题用碱溶酸沉法提取芦丁的原理是什么？为什么要控制碱的浓度？用碱溶酸沉法提取芦丁，为什么要加入硼砂水溶液？槐米中芦丁的提取,分离与鉴定实验报告一、实验目的1、通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。2、通过芦丁结构的鉴定，了解苷类结构研究的一般程序和方法。二、实验原理芦丁:浅黄色针状结晶，mp174℃-178℃。溶解度:1:8000;热水1:200;冷乙醇1:300;热乙醇1:30;冷甲醇1:100:热甲醇1:10.槲皮素:黄色结晶，mp313℃-314℃，能溶解于冷乙醇，易溶于沸乙醇，可溶于甲醇、乙酸乙酯等;难溶于水，实验室以稀硫酸水解，乙醇重结晶制得。本实验主要是利用芦丁分子中含有较多的酚羟基，显弱酸性，可溶于碱中，加酸酸化后又可析出结晶的性质，采用碱溶酸沉法提取，并用芦丁对冷、热水的溶解度相差悬殊的特性进行精制。三、药品材料槐米、石灰乳、盐酸、广泛PH试纸四、实验操作芦丁的的提取和精制芦丁的提取:取槐米20g置500ml烧杯中，加入沸水400ml及1g硼砂，搅拌下加入石灰乳调至PH8-9,保持微沸30分钟，并随时补充蒸发掉的水分，趁热用双层纱布滤过，收集滤液，药渣再用200ml水按同样的操作再提取20分钟，合并两次