纸层析的实验报告

Word1/1纸层析的实验报告篇二：氨基酸的薄层层析试验报告

试验六纸层析法观看转氨基作用

【试验名称】：纸层析法观看转氨基作用

09救援一班第三大组李岚宇20xx222336

室温：28°

（一）试验目的：

1、学习氨基酸纸层析的基本原理。

2、把握氨基酸纸层析的操作原理。

（二）试验原理：

转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：

α—酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸

本试验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的消失，以证明转氨基作用。纸层析属于安排层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶，把预分别物质加到滤纸的一端，使流淌溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流淌相的移动进行连续、动态的不断安排。由于物质安排系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，安排趋势较大的组分，随流淌相移动的速度就慢，反之，在流淌相安排趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分别，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示：ALT

物质在肯定的溶液中的安排系数是肯定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分别的物质。

（三）试验材料与仪器：

试剂：

1、0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液。

2、0.2mol/LNa2HPO4溶液81ml与0.2mol/LNaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。

3、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至100ml。

4、0.1mol/Lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0NNaOH认真调至pH7.4后，加磷酸盐缓冲液至100ml。

5、0.1mol/L谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0NNaOH认真调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至50ml。

6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5克于100ml丙酮中溶解。

7、层析溶剂：将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置24小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。

仪器：玻璃匀浆器、10ml试管、培育皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。

（四）试验步骤:

1、肝匀浆制备：取新奇动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液1.0ml,快速研成匀浆，用上述缓冲液4.5ml混匀备用。

2、酶促反应过程

（1）取离心管两支，编号：1（测定管）、2（对比管），各加肝匀浆0.5ml。把对比管放沸水浴中加热10分钟，取出冷却。

（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5ml,0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5ml,0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液1.5ml,摇匀。

（3）37℃保温，30分钟后取出，保温完毕。

（4）把测定管放沸水浴中煮10分钟，取出后冷却，过滤。

3、层析

（1）取圆形滤纸一张（直径9cm）放雪白纸上，以圆点为中心，约1cm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。

（2）点样：用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4处。把测定液、对比液分别点在原点1、3处。留意斑点不宜过大（应在直径0.5cm以下）。在第一次点样点干后，再在原处同样点第2次。

（3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。

（4）把滤纸平放在上述培育皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培育皿盖。可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周集中。当层析液前缘到离滤纸边缘约1cm时，约25分钟，取出滤纸，用镊子当心取下纸芯，放入烘箱中烘干。

（5）显色：将上述滤纸平放在培育皿上，滴0.5％茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部潮湿，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑消失，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。

（五）试验结果记录：

（六）试验争论：

1、从表格（1）中可以看出，测定管上清液点样消失了两个色斑，依据Rf值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质b为谷氨酸，则未知溶质a为丙氨酸；对比管中由于酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只