外来入侵昆虫种类的分子鉴定技术规范编制说明

外来入侵昆虫种类的分子鉴定技术规范编制说明一、工作简况：包括任务来源、协作单位、主要工作过程、起草组组成成员及其所做的主要工作等；“外来入侵昆虫种类的分子鉴定技术规范”的研究来源于西北农林科技大学承担的陕西省农业创新专项资金项目“苹果蔬菜外来入侵物种快速检测技术研发与应用”。协作单位为榆林市榆阳区孟家湾区域农业技术推广站。外来生物入侵指的是某种生物从天然存活地自然或人为传入新的地域，由于缺乏天敌在新地域产生竞争优势地位，给当地生态系统造成破坏，使其失去原有的稳定状态的一种生态性为害。外来入侵物种会通过破坏生态系统和其自身成为优势种是物种单一化而影响物种多样性，严重影响国家粮食安全、生态安全、生物安全、农产品贸易安全，以及国民经济发展与生态的可持续性。我国是受外来入侵生物为害最严重的国家之一。目前已知入侵物种超过2000种，其中700种已经造成了重大的经济损失。确定其种类是外来入侵生物监测和治理技术的基础。我国外来入侵昆虫数量约140余种。近20年来，我国平均每年以入侵昆虫为主的新发疫情5-7种，是20世纪90年代的10倍。入侵昆虫具有强大的繁殖、扩散和适应能力，极易在入侵地造成巨大的经济和生态损失。因此，加强对外来入侵昆虫的预警监测及防控是我国当前重大的国家战略需求。陕西省已发现外来入侵昆虫超过30余种，且多为体型微小种类。实践发现，自然生态环境中小体型昆虫种类繁多，且存在多型多态现象，要将体型较小的外来入侵昆虫准确的从本地种中区分开来，需要专业的昆虫分类学知识和专门的仪器，这对大多数一线工作这来讲存在现实的困难。DNA条形码技术是利用一段物种特有的、在种内稳定遗传的DNA序列作为物种快速鉴定的标记来鉴定生物物种的技术。基于线粒体COⅠ基因的DNA条形码技术在生物物种分类鉴定中具有较好的效果，在外来入侵生物的鉴别和动植物检验检疫中发挥了重要的作用。相对于形态鉴定更能反应物种的本质，特别适用于体型微小的昆虫的鉴定。目前，各市级及以上农业科学研究院和医院基本具备了进行简单分子生物学的能力。申请者在2022-2023年度参与陕西省外来入侵生物普查调查过程中发现，经过简单的培训，由基层一线工作人员先采集疑似外来入侵害虫的酒精标本，再送至能进行基础分子生物学的实验室，采用DNA条形码技术获得其分子标签序列，就能准确地确定小型外来入侵昆虫的种类。因此，制定本技术规范对外来入侵昆虫的种类鉴定、早期检测和治理意义重大。主要起草人中，张皓为项目组负责人，负责该课题的设计和实施，胡想顺全面负责鉴定方法的研究与本标准文件的起草，刘彦飞、刘焕星、杨杰、刘小凤、李苗苗和陈艳芬等人参与本标准文件的起草和验证实施。二、标准编制原则和确定标准主要内容：包括技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等的依据（包括试验、统计数据）；地方标准修订项目还应当列出和原标准主要差异情况；1．陕西省地方标准编制原则本标准的编制依据《中华人民共和国标准法》和《地方标准管理办法》的规定进行编制。本规范符合地方标准制定范围（重点支持的项目//5.生态环境领域//生物多样性保护和恢复/有害生物防治）；不在《通知》13条不予立项的范围；不存在利用地方标准实施妨碍商品、服务自由流通等排除、限制市场竞争的行为。2．确定地方标准主要内容本文件规定了外来入侵昆虫的田间调查、取样和分子鉴定等要求。本文件适用于外来入侵昆虫种类的分子鉴定。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1876医用媒介生物标本采集、制作及保存规程SN/T2752.4卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员SN/T4278国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用三、试验验证：包括试验（或验证）准确度、可靠性、稳定性的分析和说明，实验结果综述等；申请人研究团队长期从事外来入侵昆虫相关的研究工作，2022-2023年在参与陕西省外来入侵生物普查中发现，经过简单的培训，由基层一线工作人员先采集疑似外来入侵害虫标本保存于75%酒精中，再送至专业实验室采用了形态学结合DNA条形码技术相结合的方法进行鉴定，能准确地确定小型外来入侵昆虫的种类。申请人研究团队对陕西省榆林地区采集的疑似外来入侵昆虫进行了DNA条形码鉴定，成功的将外来入侵害虫西花蓟马、美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、烟粉虱地中海隐种、番茄潜叶蛾、苜蓿籽蜂和二斑叶螨从本地种中区分了出来。鉴定标本1000多份。DNA条形码技术用于物种鉴定准确率99%以上，具有技术上的先进性。目前普通实验室50个样本以内的单样成本100元左右，超过50个样后单样成本50元。符合经济上的合理性。四、知识产权说明：标准涉及的相关知识产权说明；本标准知识产权归研制单位所有，没有知识产权争议。DNA条形码技术是常规PCR技术，所用引物为学界公开的通用引物，不涉及技术专利。五、采标情况：采用国际标准和国外先进标准的程度或与国内同类标准水平的比较；不与现行法律政策相抵触（生物安全范畴）在本行业标准体系建设指南范围内农业农村部2021-11发布了农业行业标准NY/T3959-2021《农业外来入侵昆虫监测技术导则》；本规程在其建设范围内。外来入侵相关同类型标准包括：NY/T1866-2010《外来入侵植物监测技术规程黄顶菊》，NY/T1865-2010《外来入侵植物监测技术规程薇甘菊》，NY/T1864-2010《外来入侵植物监测技术规程紫茎泽兰》，NY/T1863-2010《外来入侵植物监测技术规程飞机草》，NY/T2530-2013《外来入侵植物监测技术规程刺萼龙葵》，NY/T2688-2015《外来入侵植物监测技术规程长芒苋》，NY/T3076-2017《外来入侵植物监测技术规程大薸》，NY/T3017-2016《外来入侵植物监测技术规程银胶菊》。这些均以植物为主，尚无昆虫相关的监测技术规程或鉴定规程。本文件适用于对农业外来入侵昆虫的监测和调查。昆虫DNA条形码相关标准包括：SN/T4278-2015《国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程》，SN/T5175-2021《国境口岸蚊类DNA条形码鉴定规程》，SN/T2776-2011《国境口岸医学媒介生物检测实验室管理要求SN/T》，3302-2012《国境口岸医学媒介生物实验室建筑设计规范》，SN/T4280.1-2015《国境口岸红头丽蝇DNA条形码鉴定方法》，SN/T4280.4-2016《国境口岸美洲大蠊形态及DNA条形码鉴定方法》，SN/T4280.2-2016《国境口岸德国小蠊形态及DNA条形码鉴定方法》，SN/T4280.3-2016《国境口岸澳洲大蠊形态及DNA条形码鉴定方法》，SN/T1415-2004《国境口岸医学媒介生物控制标准》，SN/T1848-2022《植物有害生物鉴定规范》，SN/T4279-2015《国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定实验室管理规范》，SN/T4278-2015《国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程》，SN/T5337-2021《动物疫病传播媒介蜱种类鉴定技术规范》等。这些均针对尚未入境检疫性生物，不是已经入侵到国内的昆虫，这为本标准提供成熟技术示范。六、重大意见分歧的处理：包括处理过程、依据和结果；无重大分歧意见。七、标准性质的建议说明：建议审批发布为推荐性标准或强制性标准的说明及理由；由于本标准涉及我省乃至我国外来入侵生物安全的重大问题，建议将本标准作为推荐性地方标准批准发布，用于指导和规范外来入侵昆虫的鉴定与监测。

八、其他应予说明的事项。相关的科研成果如下：专利张皓,马琦,胡想顺,黄卫利,陈雨馨.一种鉴定黑森瘿蚊的引物对及其鉴定方法.CN114807383A,2022-07-29.张皓,马琦,胡想顺,黄卫利,高梦瑶,姚俊,张忠扬,李志慧.一种检测黑森瘿蚊的LAMP引物组及其鉴定方法.CN116732189A,2023-09-12.发表文章HuXS,PengJF,WangH,HanSQ,LiJW,YanFY,ZhouZF,ZhangH,LiuTX.EarlymonitoringofparasitismbyAphidiinaeparasitoidsonthegrainaphidSitobionmiscanthiinwheatfieldsusingDNAbarcoding.PestManagementScience,2023,79(4):1381-1387.ChuD#,HuXS#,GaoCS,ZhaoHY,NicholsRL,LiXC.UseofMitochondrialCytochrome