DB21T 2589-2016 东部白松种源相关序列多态性(SRAP)分子鉴定实验方法　　

DB21DB21/T2589—2016东部白松种源相关序列多态性（SRAP）分子鉴定实验方法TechnicalregulationsofmolecularidentificationmethodfordifferentprovenancesofPinusstrobuswithSRAP辽宁省质量技术监督局发布I 1 1 1 1 1 2 2 2 5 6 7 9 本标准依据GB/T1.1-2009的本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为规范性附录，附录E为资1本标准适用于利用相关序列多态性（SRAP）法对东部白松种源件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用3.1相关序列多态性sequence-relatedamplifiedpolymorph利用一对引物对开放阅读框（openreadingframes，ORFs）进行扩增，因个体不同以及物种的内在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异扩增待定DNA一对引物在两个或两个以上不同材料基因组DNA之间扩增，得到数目不同或2选用东部白松新鲜针叶为材料提取基因组DNA。选取适量样品，装入冻存管，液氮速冻，置于超低），3凝胶上电泳，稳压90V，电泳缓冲液为1×TBE，325nm紫外灯下观察，），），4认边条与两玻璃板均对齐后，将其放入封胶框中并用夹子固定在配制1%的琼脂糖凝胶，彻底煮沸后用胶头滴管吸取，沿底边从左至右缓缓灌注入封胶框中，避免在50mL8%非变性聚丙烯酰胺储备液中加入100μL10%将固定有封好玻璃板的制胶板向后倾斜放置，配好的8%非变性聚丙烯酰胺工作液沿玻璃板壁缓慢5将胶小心取出，用双蒸水冲洗一次后迅速放入10%冰乙酸中，水平摇床轻摇3min～5min，放净固选取电泳图上清晰、易于辨认的多态性条带进行记录和统计，根据DNA分子量标准（将待测种源的电泳结果与原种源的标准谱带相比较，从而鉴定出该种源的6me1me2me3me4me5me6me7me8me9me107B.10.5mol/LEDTA-二钠（pH8.0）8.0，用超纯水定容至100mL，高压灭将24.22g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于160mL水中，用浓盐酸（HCl）调剂pH至8.0，用超纯将58.44g氯化钠（NaCl）溶于160mL水中，定容至200mL，高压灭菌，4CTAB-free缓冲液的成分为250mmol/LNaCl、200mmol/LTris-HClEDTA（0.5mol/LpH8.0）。在6（pH8.0）、100mL50mmol/LEDTA（pH8.0），定容至1004×CTAB提取缓冲液的成分为4%（质量浓度）溴代十六烷基三甲胺（CTAB）、10（1mol/LpH8.0）、20mmol/LEDTA（0.5mol/LpH8.0）和1.4mol/LNaCl（5mol/L）。在500mLEDTA（pH8.0）和280mL5mol/LNaCl，定容至1000mL，高压灭菌，4），溶液透明（确保所有琼脂糖颗粒均完全熔化），冷却至50℃~60℃,加入EB（1mg/mL）溶液使其终浓度为0.5μg/mL，混匀后倒入放完全凝固后放入电泳槽中，然后向槽内加入1×TBE稀释缓冲液至液面刚好没过8B.106×DNA上样缓冲液电泳(DN6×DNALordingBuffer，其中含0.05%（质量分数）溴酚蓝、0.05%（质量分数）二甲苯青、30的比例，混合DNA样品和DNA上样缓冲液，直接加到点样孔即可。9表C.210%过硫酸铵（ammoniump过硫酸铵（ammoniumpersu表C.310倍三羟甲基氨基甲烷-硼酸-冰乙酸（glacialaceticDB21/T