基因编辑Cas9系列讲座1CRISPR-Cas9基因编辑技术及其基本应用

®CRISPR-Cas9

基因编辑技术及其应用解螺旋

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知识金牌知识金牌解

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长Contents课程目录第一部分第二部分下节课程基因编辑技术的历史与发展CRISPR/Cas9原理及其技术基本应用dCas9相关应用CRISPR-Cas9

基因编辑技术及其基本应用基因编辑技术的历史与发展01知识金牌无模板：随机修复（NHEJ）有模板：重组修复（HDR）Knock

out

Knock

inCRISPR-Cas9

基因编辑技术及其基本应用解

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长知识金牌ZFN解

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长TALEN第一部分

|基因编辑技术的历史与发展--ZFN与TALEN知识金牌来源于细菌和古细菌的免疫系统靶向切割外源入侵者的DNA解

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长间隔序列第一部分

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基因编辑技术的历史与发展-CRISPR-Cas9起源知识金牌Cas9特点三要素：Cas9,crRNA,

tracrRNA识别模式：

RNA-DNA

；

识别长度20

bp，

末端紧邻PAM序列

(NGG)Cas9本质上是RNA依赖的DNA内切酶含有两个切割结构域，精确切割在PAM之前3bp处Cas9优点设计简单，简明的碱基互补设计原则识别不受基因组甲基化影响能靶向几乎任意细胞任意基因方便同时靶向多个靶点切割效率高第一部分

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基因编辑技术的历史与发展-CRISPR/Cas9解

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长知识金牌ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9比较第一部分

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基因编辑技术的历史与发展解

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长CRISPR/Cas9技术原理应用02知识金牌靶向DNA的基因编辑技术；sgRNA引导cas9蛋白到达指定靶点；Cas9蛋白切割DNA；遗传物质被破坏，但是生物体具有自我修复机制，随着细胞复制分裂，努力修复切口；修复的过程，产生错配，移码突变、缺失突变；筛选出错配纯合子；基因组水平的基因编辑 第二部分

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CRISPR/Cas9技术应用--Cas9原理解

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长知识金牌RNAiCRISPR-CAS9作用水平mRNA水平基因组水平靶向范围转录本外显子、内含子、启动子等所有基因组序列靶蛋白敲除水平部分敲除完全敲除靶蛋白功能部分丧失完全丧失基因表型的呈现度不一定呈现一定呈现同一基因多靶点表型一致率20±12%78±27%解

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长参考文献：

Science.

2014

Jan3;343(6166):84-7.

doi:10.1126/science.1247005Genome-scale

CRISPR-Cas9

knockout

screening

in

human

cells.第二部分

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RNAi与CRISPR-Cas9在基因功能研究学中的比较知识金牌sgRNA比shRNA均一性高解

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长第二部分

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RNAi与CRISPR-Cas9在基因功能研究学中的比较Fig.1

Lentiviral

delivery

of

Cas9

and

sgRNAprovides

efficient

depletion

of

target

genes知识金牌普通编码基因敲除筛选插入或缺失非3的倍数个碱基突变的纯合子NHEJ（KNOCK-OUT）No.1解

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长第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用知识金牌解

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长第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用知识金牌参考文献：Awuah

SG,

et

al.

Repair

shielding

of

platinum-DNA

lesions

in

testicular

germ

cell

tumors

byhigh-mobility

groupbox

protein

4imparts

cisplatin

hypersensitivity.

Proc

Natl

Acad

Sci

U

S

A.

2017

Jan

31;114(5):950-955.

28096358睾丸生殖细胞瘤对顺铂敏感性下降转染6周Cas9基因敲除稳转株后，WB检测结果第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用案例解

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长知识金牌第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用案例解

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长

NHEJ（KNOCK-OUT）应用文章 Targeting

SAMHD1withthe

Vpx

protein

to

improve

cytarabinetherapy

for

hematological

malignancies.

Nature

Medicine.

2017RandomSplicingofSeveralExonsCausedbyaSingleBaseChangein

the

Target

Exon

of

CRISPR/Cas9

Mediated

Gene

Knockout.

Cell.

2016.BCL11A

enhancer

dissectionby

Cas9-mediated

in

situsaturatingmutagenesis.

Nature.

2016.Repair

shielding

of

platinum-DNA

lesions

in

testicular

germ

celltumors

by

high-mobility

group

boxprotein

4

imparts

cisplatin

hypersensitivity.

PNAS.

2016.IF:

30.357IF:

28.710IF:

38.138IF:

8.303知识金牌解

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长目的细胞预实验病毒感染预实验确定MOI感染过病毒的细胞单克隆生长，确定细胞增值Puro浓度预实验Blast浓度预实验按照MOI感染LentiCas9-

Blast感染72HBlasticidin筛选48H换液Blasticidin筛选48HCell-Cas9稳转株半药维持RT确定Cas9表达按MOI感染目的gRNA感染72HPuro筛选48H换液Puro筛选48HCell-Cas9-gRNA稳转株

半药维持继续培养细胞充分切割一周提取DNA，PCR出gRNA位点上下游约200bp测试PCR引物PCR产物送测根据测序峰图杂峰情况，选出最优靶点细胞分单克隆需要30个以上单克隆单克隆生长选择10个提DNA，PCR送出选择测序峰图为双峰的DNA，TA

克隆，送测8个斑根据TA克隆结

果，找到双切纯合子是否双切纯合子扩大培养，即为所得目的细胞

有无选择10个单克隆提DNA送测继续上述过程，直到找到纯合子gRNA载体构建+病毒包装第二部分

|

CRISPR/Cas9技术应用-慢病毒Cas9应用知识金牌适用于lncRNA，miRNA，启动子，内含子,编码序列等；大片段删除No.2第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用解

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长知识金牌第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用原序列切除克隆示意图gRNA1gRNA2······解

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长知识金牌参考文献：LuR,etal.EpigeneticPerturbationsbyArg882-MutatedDNMT3APotentiateAberrantStemCellGene-ExpressionProgramandAcute

Leukemia

Development.

CancerCell.

2016

Jul

11;30(1):92-107.27344947CovarrubiasS,etal.CRISPR/Cas9-basedscreeningoflongnoncoding

RNAs(lncRNAs)inmacrophageswithanNF-kappaBreporter.JBiolChem.

2017

Oct19.29051223解

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长第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用案例知识金牌参考文献：YangS,etal.CRISPR/Cas9-mediatedgeneeditingamelioratesneurotoxicityinmouse

model

of

Huntington‘s

disease.

J

Clin

Invest.

2017

Jun

30;127(7):2719-2724.

28763160解

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长第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用案例知识金牌

大片段删除应用文章 解

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长mTORC1

and

muscle

regeneration

are

regulated

by

the

LINC00961-

encodedSPAR

polypeptide.

Nature.

2016.Epigenetic

Perturbationsby

Arg882-MutatedDNMT3A

PotentiateAberrantStemCellGene-ExpressionProgramandAcuteLeukemiaDevelopment.

Cancer

Cell.

2016.Challenges

of

CRISPR/Cas9

applications

for

long

non-coding

RNAgenes.

Nucleic

Acids

Researc.

2016.EffectiveknockdownofDrosophilalongnon-codingRNAsbyCRISPRinterference.

Nucleic

Acids

Research.

2016.Targeting

non-coding

RNAs

with

the

CRISPR/Cas9

system

in

humancell

lines.

Nucleic

Acids

Research.

2016.IF:

38.138IF:

23.214IF:

9.202IF:

9.202IF:

9.202第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用知识金牌293，Hela细胞适用同源定向修复（homology-directed

repair,HDR）；精确插入碱基。KNOCK-INNo.3第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用解

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长知识金牌

KNOCK-IN文章分析 双切割HDR

Donor显着提高CRISPR介导的DSB后293T细胞的HDR效率解

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长参考文献：ZhangJP,etal.Efficientpreciseknockinwithadouble

cut

HDR

donor

afterCRISPR/Cas9-mediated

double-stranded

DNA

cleavage.

Genomebiology(2017)

20;18(1):35.

28219395第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用知识金牌第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用PRDM14基因位点敲入解

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长知识金牌第二部分

|CRISPR/Cas9技术应用-Cas9应用Puro筛选后，细胞大量死亡解

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