色谱法在精细化工中的应用课件

色谱法在精细化工中的应用3-3高效液相色谱3.3高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）是以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的分离分析方法。3-3高效液相色谱特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。溶质在液体中的扩散系数比气体中约小105倍液体粘度比气体约大102倍液体表面张力比气体约大104倍液体密度比气体约大103倍液体不可压缩一、高效液相色谱法的特点3-3高效液相色谱二、高效液相色谱法的应用与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品预处理简单，分离效率高，流动相选择范围广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可回收等优点。高效液相色谱法主要用于化合物的分离、鉴定、纯化以及定量。3-3高效液相色谱三、高效液相色谱法的几种类型HPLC液-固吸附液-液分配正相色谱反相色谱一般反相色谱离子对色谱离子抑制色谱离子交换色谱一般离子交换色谱离子色谱氨基酸分析凝胶色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱键合相色谱3-3高效液相色谱四、高效液相色谱仪检测器高压泵脱气装置色谱柱进样阀流动相3-3高效液相色谱多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，将流动相源源不断地输送到色谱柱中。柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响，泵压最高为400kg/cm2。这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双泵补偿法来克服这一问题。输液泵3-3高效液相色谱3-3高效液相色谱避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物，四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混合物，含强络合剂的溶液等。注意流动相使用前

使用含酸、碱、缓冲液的流动相后，必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！冲洗3-3高效液相色谱3-3高效液相色谱3-3高效液相色谱3-3高效液相色谱进样阀3-3高效液相色谱1柱泵324定量圈进样孔6废液5废液Inject6柱泵3214定量圈进样孔废液5废液Load3-3高效液相色谱注意：使用后应清洗！3-3高效液相色谱进样注意点进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置，以免虹吸作用，使样品向针筒方向回流，或从废液口流出。使用前后，要用流动相（不含酸碱等缓冲液）或甲醇或水冲洗针孔，用针孔清洗器）。3-3高效液相色谱进样方法整个定量圈体积进样——为获得好的精密度，进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于层流影响，需要有过量的样品液来取代管壁上的流动相（见下图）。SampleMobilephase3-3高效液相色谱例20l定量圈，进样体积不能超过10l。否则，部分样品将会从出口流失。这是因为由于层流的关系，样品流经管中心的速度是平均速度的两倍。进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前一针留下的样品。注射针必须清洗干净。部分定量圈体积进样——当样品量少时，采用部分体积进样，进样量由微量注射器手动控制，要求：不得超过定量圈体积的1/2量3-3高效液相色谱色谱柱色谱柱由柱管和固定相组成，柱管用不锈钢制成，柱长10～30cm，内径2～6mm，以4.6mm的内径最常用。根据键合基团极性不同，化学键合相可分为非极性、中等极性和极性三类。常用色谱柱有：ODS柱、氰基柱、氨基柱等3-3高效液相色谱色谱柱使用注意点：pH范围2-11.5。使用有机缓冲液，浓度以10-50mM为好。在中高pH下避免使用磷酸盐，碳酸盐缓冲液，最高操作温度60℃，最佳温度﹤40℃。分离碱性物质，所用流动相pH值应高于被测物pKa一个单位。3-3高效液相色谱

柱pH范围最高温度

SBC1890℃C860℃C360℃

苯基60℃

腈基60℃XDB60℃Extend-C1860℃123456789101112ZORBAXRP-HPLC系列柱的使用条件3-3高效液相色谱色谱柱使用与保存所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积20-30倍的水冲洗色谱柱色谱柱柱体积冲洗体积150×4.6mm2.5ml50ml200×4.6mm3.3ml65ml250×4.6mm4.2ml80ml3-3高效液相色谱色谱柱失效症状色谱柱压增高峰变宽，拖尾，裂峰塔板数下降，选择性下降，分离度降低保留值减小或增大色谱柱失效的原因进口滤片堵塞、吸附了样品杂质柱填充不良,使用久,机械及热冲击造成空洞固定相遭化学侵蚀3-3高效液相色谱强保留样品组分——强吸附组分易聚集在柱进口填料上，严重缩短色谱柱寿命。尤其是生物样品提取物、含油成分等。当严重拖尾峰出现时往往是强保留污染物在柱口处聚集的信号。色谱柱柱压升高的原因解决办法使用保护柱可延长分析柱寿命。每天实验后应用强溶剂（例甲醇-水等，至少20-30倍柱体积的量）冲洗色谱柱。并定期进行保养，以低流速的强溶剂较长时间冲洗色谱柱。3-3高效液相色谱Question1注意！

一旦柱压升高，应停止测定，用水冲洗数小时或更长时间，待压力下降后再测定，如果不清楚堵在哪一段，则应逐级检查，换泵头上滤芯，保护柱等。3-3高效液相色谱检测器紫外检测器可变波长检测器光电二极管阵列检测器示差检测器电化学检测器蒸发光散射荧光检测器质谱3-3高效液相色谱色谱图minH光谱图nm