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DB51DB51/T2685—2020猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（CPA）检测方法2020-07-14发布2020-08-01实施四川省市场监督管理局发布I 1 1 1 1 2 2 2 3 4 6 7 81GB/T6682分析实验室用GB/T25172—2010猪常温精液SN/T3567.1—2013交叉引BstDNA聚合酶（BstDNApolym24.4普通冰箱：2℃~8℃。4.8高压灭菌锅。4.9干烤灭菌器。6.10伪狂犬病毒阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照使用灭活疫苗或组织培养37.2.5组织样品采集：取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、三叉神经节、扁桃采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品，在2℃-8℃下保存应不超过24h，-20℃±5℃下8.1.1核酸提取区进行操作。DNA提取使用DNAzol手工提取，也可以使用商品化试剂盒提取。8.1.4取900μL上清，置于新的1.5ml8.1.6用30μL8mmol/LN在试剂准备区进行。设CPA反应管为n,n为待检样品数量加上阴阳性对照方法一：将PCR反应管置恒温设备(水浴锅、金属浴)上，63℃避光温浴35min。方法一：实验室若暂时无石蜡油，可将PCR管置于普通PCR仪，程序设置热盖105℃,样品孔63℃,将恒温扩增后的PCR反应管(不可开盖，以避免污染)放入一次性核酸检测装置(含核酸检测试纸条)(按照SN/T3567.1—2013中附录B操作),检查液泡有无漏液以及是否在下图(图1)所示位置，蜜放入内中图1操作示意图试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区(C线),一条位于检测区(T线),结果判定为阳性。试纸条质控区(C线)出现一条红色条带，检测区(T线)没有条带，结果判定为阴性。试纸条质控区(C线)和检测区(T线)均未出现条带，或仅检测区(T线)出现红色条带，检测结果无效。表明试纸条已损坏、失效或者操作有误。此时应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。(图2)□□TCTTCT图2检测结果判读示意图456 7 PRVgEp15'-ACGAGCCCCGCTTCCA-3’PRVgEp25'-CATGTCCGAGACCACGCGCGTCCACTCGCAGCTCTTCT-PRVgEp3PRVgEp45'-Biotion-CATGTCCGAGACCACGCGCG-3’PRVgEp55'-CCAGCGTGGCGGTAAAGTTCTC-3’PRVgEp6注：引物和探针可由生物公司合成，用TE溶液溶解并稀释至100μmol/L储存浓度，-20℃保存备用，保存期为1年；8 PRVgEp1（40μmol/L）PRVgEp2（40μmol/L）PRVgEp3（40μmol/L）PRVgEp4（40μm

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