《化妆品 抗羰基化活性的评价 秀丽线虫法》

ICS71.100.70

CCSY40

团体标准

T/GDCA001—2023

化妆品抗羰基化活性的评价秀丽线虫法

Cosemtics-Evaluationofanti-carbonylationactivity-caenorhabditiselegansassay

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

广东省化妆品学会发布

T/GDCA001—2023

化妆品抗羰基化活性的评价秀丽线虫法

1范围

本文件规定了运用秀丽线虫（以下简称线虫）评价化妆品抗羰基化活性的方法原理及操作。

本文件适用于化妆品（精华、乳液、膏霜等）的抗羰基化活性的功效评价，化妆品原料可参考本文

方法。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

T/GDCA013—2022化妆品抗氧化活性的评价秀丽线虫法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

蛋白质羰基化ProteinCarbonylation

蛋白质羰基化被视为氧化应激和衰老的生物标志物，是蛋白质非酶促不可逆的羰基修饰。蛋白质可

与不同来源的活性羰基类物质（reactivecarbonylspecies，RCS）反应，生成蛋白质羰基加合物，也

能自身氧化生成蛋白质羰基衍生物。羰-氨交联启动的蛋白质交联聚合是老年色素形成的核心生化机制。

肠脂褐质Intestinallipofuscin

肠脂褐素，又被称为“老年黑色素”，是线虫衰老的标志物，在线虫肠道中积累并且能够自发荧光。

肠脂褐素已被证明可抑制蛋白酶体并促进细胞内活性氧的形成，在线虫肠道中合成的羰基化蛋白是线

虫肠脂褐质的主要成分。

4检测原理

随着秀丽线虫虫龄增长，肠道中以羰基化蛋白为主要成分的肠脂褐质开始积累。线虫体内羰基化蛋

白的积累与肠脂褐质荧光强度呈正相关。将同期化的线虫置于含化妆品或原料的培养基上培养10天，然

后使用荧光显微镜以350/50nm（中心波长/带宽）波长激发肠脂褐质，并在460/50nm波长下检测线虫的

自发荧光。使用ImageJ软件量化线虫的荧光强度值，并以空白组作为对照，计算样品组线虫的荧光强

度抑制率，从而反映受试样品的抗羰基化活性。

5材料与试剂

材料

5.1.1秀丽线虫（以下简称线虫）：N2野生型秀丽线虫（Caenorhabditiselegans,theBridtolstrain

N2））购自秀丽线虫遗传学中心（CaenorhabditisGeneticsCenter，USA）

5.1.260mm培养皿

5.1.3挑虫器wormpicker

试剂

除非另有说明，化学试剂使用符合国家标准的分析纯试剂。配制方法见附录A。

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氯化钠（NaCl）、硫酸镁（MgSO4）、氯化钙（CaCl2）、氢氧化钠（NaOH）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、

磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸氢二钠十二水（Na2HPO4•12H2O）、技术琼脂粉、LB肉汤、胰蛋白胨、硫酸链

霉素、胆固醇、次氯酸钠（NaClO）、无水乙醇、左旋咪唑、琼脂糖、PBS（1×）

阳性对照品

肌肽粉末CAS#:305-84-0

6实验仪器与设备

连续变倍体视显微镜，物镜变倍范围0.7×～4.5×

震荡培养箱：精度±1℃

生化培养箱：精度±1℃

超净工作台

万分之一天平：精度0.1mg

高压灭菌锅

电热恒温水浴锅

荧光显微镜

低速离心机，适配2mL离心管

7实验步骤

实验准备

繁殖期（3d～5d龄）野生型秀丽线虫用于同期化。

样品

样品包含化妆品原料及产品。配制样品测试溶液时，首选溶剂是M9缓冲液或无菌水，如需用到有机

溶剂助溶，可选用二甲基亚砜（DMSO），溶剂于测试溶液中的浓度要≤2%。针对不同样品，需结合其特

性调整前处理方法，具体可参照附录B。

线虫NGM的配制

7.3.1处理组NGM的配制

按T/GDCA013—2022的规定进行实验。

7.3.2阳性对照组NGM的配制

阳性对照肌肽组：用蒸馏水配置1mg/mL母液，取E.coliOP50菌液和肌肽母液按95：5比例混合均匀，

用移液枪吸取150μL菌液轻缓地打在每个NGM平板上中央。NGM平板避光晾干后封膜，4℃保存备用。为

保证样品活性，样品板限制在一周内使用。

8实验方法

线虫同期化

按T/GDCA013—2022的规定进行实验。

预测试

按T/GDCA013—2022的规定进行实验。

秀丽线虫荧光强度测定

将L4期幼虫转移至空白组或样品组NGM上，每隔一天需将线虫挑至新的NGM板上。培养10天后，用M9

缓冲液清洗线虫3次。吸取少量6mmol/L左旋咪唑滴在3%琼脂糖垫载玻片上，每个处理组挑选至少30条线

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虫转移至左旋咪唑液滴中以麻醉线虫至无任何反应，拍摄荧光图像以及明场图像并对图像中每条线虫

虫体的荧光强度进行相对定量分析。

9结果评价

统计学分析

每个组别设置3个平行皿培养线虫。采用ImageJ软件对图像中线虫肠脂褐质的荧光强度进行相对定

量分析（分析方法见附录C），得到各组荧光强度值和相对荧光强度值。采用GraphPadPrism软件绘

制柱状图，t-test分析组间差异，p＜0.05表示有显著性差异。

荧光强度抑制率计算见公式（1）：

푇

抑制率(%)=(1−)×100%···························································(1)

퐶

式中：

T-样品组的平均荧光强度值；

C-空白组的平均荧光强度值；

注：相对相对荧光强度值即T/C×100%

结果判定及说明

荧光强度抑制率大于0，且样品组荧光强度值与空白组荧光强度有显著性差异（p＜0.05），说明该

样品在该浓度下，能抑制线虫肠脂褐质的生成，具有抵抗机体蛋白质羰基化的能力，可作为抗羰基化活

性评价的证据支撑。

在同一批次实验中，通过比较不同样品处理下线虫荧光强度抑制率来判定其抗羰基化活性强弱。线

虫荧光强度抑制率越高，则该样品抗羰基化活性越强。

10实验有效性的条件

样本量要求

每个处理组用于拍摄线虫荧光图像的数量不少于30条。在培养过程和清洗虫体过程中会损失一部

分线虫样本，建议在样品干预初期每个处理组的线虫不少于90条，以补偿一些样本的损失。

同期化实验质量控制

同期化化实验得到受精卵后26h左右孵化为L1期的幼虫。若同期化26h后幼虫孵化率小于95%，则同

期化实验失败。

样本剔除标准

死亡状态下线虫通体会产生弥漫性蓝色荧光（俗称“死亡荧光”），荧光强度激增。实验中线虫若

出现激增的死亡荧光，需要剔除该死亡样本（见附录D）。

统计学差异

荧光强度抑制率小于0，或空白组与样品组荧光强度值之间不存在统计学上的显著性差异，则该样

品不具有抗羰基化活性。

批次稳定性

每次测试需要设置空白组和肌肽阳性对照组。建议初次按本文件进行抗羰基化活性评价前，先使用

肌肽得到稳定的数据，以确保实验模型的成功，再进行样品的抗羰基化活性的测定。空白组与阳性对照

组之间不存在统计学上的显著性差异，则该次实验视为失败。

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A

A

附录A

（规范性）

培养基、试剂配制方法

A.1培养基、试剂配制

按T/GDCA013—2022的规定进行实验。

A.2线虫基本操作方法

A.2.1大肠杆菌OP50的培养及涂布

按T/GDCA013—2022的规定进行实验。

A.2.23%琼脂糖垫载玻片制备

称取0.6g琼脂糖加热溶于20mLPBS缓冲液，趁热滴加一滴至载玻片上，迅速用另一片载玻片轻轻压

平，静置30s后取下上层载玻片即可使用。

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B

B

附录B

（资料性）

化妆品前处理参考方法

按T/GDCA013—2022的规定进行实验。

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C

C

附录C

（资料性）

ImageJ测定线虫荧光强度的方法

ImageJ软件测定线虫荧光强度的方法如下：

a)在ImageJ软件中打开明场图像和荧光图像（File-Open-SelectFile-Open）；

b)将明场图像和荧光图像融合（Image-Stacks-ImagestoStack-OK）；

c)设置测量项目（Analyze–SetMeasurements），在弹出界面中选择需要测量的项目Area、Mean

grayvalue、Integrateddensity；

d)选择多边形工具（菜单栏从左至右第三个绘图工具），在明场图像上完整地勾勒出线虫的轮廓，

接着移动到荧光图像通道，此时荧光图像中线虫的轮廓被勾勒选中，即可测量线虫荧光强度

（Analyze–Measure）；

e)选择椭圆形工具（菜单栏从左至右第二个绘图工具），在一个只有背景的区域画一个小形状（不

含线虫），测量背景值（Analyze–Measure）；

f)数值将显示在“Result”窗口中，选择所有测量值并复制到Excel中保存，计算面积校正后的

线虫荧光强度：线虫Mean-背景Mean。

注：ImageJ软件下载地址：/Fiji/Downloads

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D

D

附录D

（资料性）

线虫图像

线虫明场及荧光图像见图D.1

图D.1线虫明场及荧光图像

注：箭头所指为死亡状态下的线虫

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E

E

附录E

（资料性）

实验数据图表

线虫肠脂褐质的代表性荧光图见图E.1,线虫荧光强度的相对定量分析图见图E.2,肌肽对线虫荧光

强度的影响（示例）见图E.3，线虫荧光强度值记录表见表E.1。

图E.1线虫肠脂褐质的代表性荧光图图E.2线虫荧光强度的相对定量分析图

****

200

）

%150

（

度

强100

光

荧50

对

相

0

空白肌肽

图E.3肌肽对线虫荧光强度的影响（示例）

表E.1线虫荧光强度值记录表

相对荧光强度抑制率

组别

%%

空白/

肌肽

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参考文献

[1]HosokawaH,IshiiN,IshidaH,etal.Rapidaccumulationoffluorescentmaterial

withaginginanoxygen-sensitivemutantmev-1ofCaenorhabditiselegans[J].Mechanismso

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[4]Yin,D.Biochemicalbasis