化妆品中 L-麦角硫因含量的测定高效液相色谱法

化妆品中L-麦角硫因含量的测定高效液相色谱法本文件规定了化妆品中L-麦角硫因含量的高效液相色谱测定方法。本文件适用于膏霜乳类、液体类、凝胶类化妆品中L-麦角硫因含量的测定。本文件方法的检出限为0.6μg/g，定量限为1.8μg/g。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法CNAS-TRL-011-2020轻工产品化学分析方法确认和验证指南3术语和定义3.1L-麦角硫因（L-ergothioneine）化学名为2-巯基组氨酸三甲基内盐，分子量为229.3，无色无味，极易溶于水、甲醇和乙醇，是一种具有重要生理活性的稀有天然手性氨基酸。4原理化妆品中L-麦角硫因经5%甲醇水溶液提取，通过液相色谱分离后，用配有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪测定，采用保留时间和紫外光图谱定性，用峰面积定量，以标准曲线法计算含量。如液相色谱方法中检出结果存在不确定因素，可采用液相色谱-质谱法进行确证。具体见附录B。5试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，实验室用水符合GB/T6682中一级水的规定。5.1甲醇（CH3OH,CAS号：67-56-1）：色谱纯、质谱纯。5.2甲酸（HCOOH，CAS号：64-18-6）：色谱纯。5.3二氯甲烷（CH2Cl2，CAS号：75-09-2）：分析纯。5.4L-麦角硫因（C9H15N3O2S，CAS号：497-30-3）标准品：纯度≥98%。5.55%甲醇水溶液：取甲醇、水，按5:95的体积比混合，摇匀。25.60.1%甲酸水溶液：准确吸取1mL甲酸（5.2）加水定容至1000mL，混匀。5.70.1%甲酸甲醇溶液：准确吸取1mL甲酸（5.2）加甲醇定容至1000mL，混匀。5.8L-麦角硫因标准储备液配制：称取L-麦角硫因标准品10mg（精确到0.00001g）置于10mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液（5.5）溶解并定容至刻度，混匀，配制成浓度为1000μg/mL的标准储备溶液，现配现用。5.9L-麦角硫因标准工作溶液配制：准确移取一定量的L-麦角硫因标准储备溶液（5.8），用5%甲醇水溶液（5.5）逐级稀释得到一系列的标准工作溶液（质量浓度分别为0.18μg/mL、1.8μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL）。临用现配。6.0水相系微孔滤膜：0.45μm。6仪器和设备6.1高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器。6.2高效液相-三重四级杆质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。6.3天平：感量0.0001g。6.4离心机：转速不低于11000r/min。6.5超声波清洗器。6.6涡旋振荡器。7试验步骤7.1样品提取7.1.1液体类、凝胶类样品称取1.0g（精确到0.0001g）样品于10mL容量瓶中，加入5%甲醇水溶液约4mL，涡旋60s，再加入5%甲醇水溶液至瓶颈处，常温超声提取20min，用5%甲醇水溶液定容至刻度，混匀，于11000rpm离心20min，吸取上层清液，采用0.45μm水膜过滤，滤液作为待测溶液。7.1.2膏霜乳类样品称取1.0g（精确到0.0001g）样品于10mL容量瓶中，加入1mL二氯甲烷，再加入5%甲醇水溶液约3mL，涡旋60s，加入5%甲醇水溶液至瓶颈处，常温超声提取20min，用5%甲醇水溶液定容至刻度，混匀，于11000rpm离20min，吸取上层清液，采用0.45μm水膜过滤，滤液作为待测溶液。7.2测定7.2.1色谱参考条件色谱柱：ZORBAXSB-AQ-C18（4.6mm×250mm，5μm）或色谱柱效能相当者；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脱条件见表1；柱温：25℃;进样量：20μL；检测波长：258nm；3表1流动相梯度洗脱条件时间/minV（流动相A）/%V（流动相B）/%流速（mL/min）09910.699910.6505020505020.19910.6309910.67.2.2标准曲线的绘制用L-麦角硫因系列标准工作溶液（5.9），参考上述色谱条件（7.2.1）进行测定，以标准工作溶液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制L-麦角硫因的标准曲线。L-麦角硫因标准工作溶液的色谱图参见附录A。7.2.3定量测定按照保留时间和紫外光谱图进行定性，样品与相似浓度下标准品保留时间的相对偏差不大于2%，样品与相似浓度下标准品的紫外光谱图一致，标准曲线法定量。待测溶液中L-麦角硫因的响应值应在标准曲线范围内，如超出标准工作曲线0.18μg/mL~50.0μg/mL的范围，应稀释后再进样分析。7.2.4空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。8结果计算试样中的L-麦角硫因含量以质量分数ω计，数值以微克每克(μg/g）表示，按公式（1）进行：式中：ω——试样中L-麦角硫因含量，单位为微克每克(μg/g）；c——试样中L-麦角硫因的浓度，单位为微克每毫升(μg/mLV——试样定容体积，单位为毫升（mL）；K——稀释倍数；m——试样质量，单位为克（g）。计算结果保留两位有效数字。注：当待测样液中L-麦角硫因含量超过标准工作曲线范围时，进行稀释，即需进行稀释倍数换算。9精密度在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。4附录AL-麦角硫因标准工作溶液（3.0μg/mL）的液相色谱图L-麦角硫因标准工作溶液（50μg/mL）的色谱图见图A.1。图A.1L-麦角硫因标准工作溶液（50μg/mL）的色谱图L-麦角硫因的结果确证如液相色谱方法中检出结果存在不确定因素，可采用液相色谱-质谱法进行确证。在相同的试验条件下，如果样品中检出的色谱峰保留时间和紫外光谱图与标准溶液中对应成分一致，所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子对相对丰度比的偏差不超过表1规定范围，则可判断样品中存在对应的待测成分。表1结果确证时相对离子丰度比的最大允许偏差相对离子丰度（K）K＞50%50%≥K＞20%20%≥K＞10%K≤10%允许的最大偏差±20%±25%±30%±50%B.1色谱参考条件流动相：A相为水：B相为甲醇，梯度洗脱见下表2；进样量：1μL。2表2梯度洗脱程序时间/minV（流动相A）/%V（流动相B）/%流速（mL/min）09910.399910.350500.62050500.620.19910.3309910.3B.2质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI源）。监测模式：正离子多反应监测模式；监测离子对及相关电压参数设定见表3。毛细管电压：4000V。离子源温度：300℃。脱溶剂气：氮气，流速11L/min，温度30