BJS 202413 食品中大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚的测定

食品补充检验方法BJS202413四氢大麻酚的测定2024-12-22发布国家市场监督管理总局发布1BJS202413四氢大麻酚的测定1范围本方法描述了食品中大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚的液相色谱-串联质谱测定方法。大麻酚的测定。2原理试样中添加同位素内标,用乙腈提取,经固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱仪检测,多反应离子监测,以保留时间和定性离子的丰度比定性,以内标法定量。3试剂和材料除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1甲醇(CH4O):色谱纯。3.1.2乙腈(C2H3N):色谱纯。3.1.3乙酸铵(C2H7NO2):色谱纯。3.1.4氯化钠(NaCl)。3.2试剂配制3.2.1乙酸铵溶液(5mmol/L):称取0.385g乙酸铵(3.1.3),用水溶解并稀释至1000mL。3.2.25%甲醇溶液:量取5mL甲醇(3.1.1),加水稀释至100mL。3.3标准品3.3.1大麻酚(C21H26O2,CAS号:521-35-7):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品,相关信息见附录A。3.3.2大麻二酚(C21H30O2,CAS号:13956-29-1):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.3四氢大麻酚(C21H30O2,CAS号:1972-08-3):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.4大麻酚-D3(C21H23D3O2,CAS号:1435934-54-5):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.5大麻二酚-D3(C21H27D3O2,CAS号:1435783-16-6):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。2BJS2024133.3.6四氢大麻酚-D3(C21H27D3O2,CAS号:81586-39-2):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.4标准溶液配制3.4.1标准储备液分别称取大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚标准品(3.3)各约10mg(精确至0.0001g),用乙腈(3.1.2)溶解,转移至不同的10mL棕色容量瓶中,用乙腈(3.1.2)分别定容至刻度,摇匀,配制成质量浓度为1000μg/mL的标准储备液,并转移至深色容器中,于—18℃及以下密封避光保存,有效期12个月。3.4.2内标储备液分别称取大麻酚-D3、大麻二酚-D3、四氢大麻酚-D3标准品(3.3)5mg(精确至0.0001g),用乙腈(3.1.2)溶解,转移至不同的10mL棕色容量瓶中,用乙腈(3.1.2)分别定容至刻度,摇匀,配制成质量浓度为500μg/mL的内标储备液,并转移至深色容器中,于—18℃及以下密封避光保存,有效期12个月。3.4.3混合标准中间液分别准确移取标准储备液(3.4.1)1mL,置于同一100mL棕色容量瓶中,用乙腈(3.1.2)定容至刻度,摇匀,配制成质量浓度为10μg/mL的混合标准中间液,并转移至深色容器中,于—18℃及以下密封避光保存,有效期12个月。3.4.4混合内标中间液分别准确移取内标储备液(3.4.2)1mL,置于同一50mL棕色容量瓶中,用乙腈(3.1.2)定容至刻度,摇匀,配制成质量浓度为10μg/mL的混合内标中间液,并转移至深色容器中,于—18℃及以下密封避光保存,有效期12个月。3.4.5工作溶液3.4.5.1混合标准工作液A:准确移取混合标准中间液(3.4.3)1mL,置于5mL棕色容量瓶中,用乙腈(3.1.2)定容至刻度,摇匀,配制成质量浓度为2μg/mL的混合标准工作液A,并转移至深色容器中,于—18℃及以下密封避光保存,有效期1个月。3.4.5.2混合标准工作液B:准确移取混合标准工作液A(3.4.5.1)1mL,置于20mL棕色容量瓶中,用乙腈(3.1.2)定容至刻度,摇匀,配制成质量浓度为0.1μg/mL的混合标准工作液B。现用现配。3.4.5.3混合内标工作液(1μg/mL):准确移取混合内标中间液(3.4.4)1mL,置于10mL棕色容量瓶中,用乙腈(3.1.2)定容至刻度,摇匀,配制成质量浓度为1μg/mL的混合内标工作液,并转移至深色容器中,于—18℃及以下密封避光保存,有效期1个月。3.4.6系列标准工作溶液分别精密移取混合标准工作液B(3.4.5.2)50μL、100μL,混合标准工作液A(3.4.5.1)25μL、50μL、100μL,混合内标工作液(3.4.5.3)20μL,置于一组1mL的棕色容量瓶中,分别用甲醇定容至刻度,摇匀,制得质量浓度依次为5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL且内标浓度均为20ng/mL的系列标准工作溶液,或依需要配制适当浓度的混合标准系列工作溶液。现用现配。3.5材料3.5.1基质增强脂肪去除固相萃取柱(300mg/3mL)或其他等效柱。3BJS2024133.5.2官能化聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取柱(200mg/6mL)或其他等效柱。3.5.3聚四氟乙烯滤膜:0.22μm。4仪器和设备4.1液相色谱-串联质谱仪:配电喷雾离子源。4.2天平:感量分别为0.01g和0.00001g。4.3涡旋混合器:转速应不低于1500r/min。4.4冷冻离心机:转速应不低于10000r/min,可0℃~4℃控温。4.5固相萃取装置。4.6氮吹仪。4.7匀浆机。4.8组织捣碎机。4.9超声仪:≥40KHz。5分析步骤5.1试样制备和保存5.1.1液体试样和粉状固体试样(食用植物油、液体饮料、固体饮料等)取多个包装试样,充分摇匀(含二氧化碳的试样,超声除去气泡后摇匀),并在一个容器中搅拌均匀,装入洁净容器中密封并标记,于0℃~4℃避光保存。5.1.2糖果试样取多个包装试样,于—18℃以下冷冻过夜,取出后立即用组织捣碎机捣碎,搅拌均匀(胶基糖果样品需剪小块后置于组织捣碎机捣碎均匀),装入洁净容器中密封并标记,于0℃~4℃避光保存。5.1.3巧克力试样取多个包装的试样,50℃~60℃加热熔融后,用匀浆机趁热充分搅拌均匀,装入洁净容器中密封并标记,于0℃~4℃避光保存。5.1.4其他半固体或固体试样取多个包装试样,用组织捣碎机捣碎,搅拌均匀,装入洁净容器中密封并标记,于0℃~4℃避光保存。5.2样品前处理5.2.1提取5.2.1.1食用植物油称取试样1g(精确至0.01g)于10mL聚丙烯离心管中,加入40μL混合内标工作液(3.4.5.3),再加入5mL乙腈(3.1.2),涡旋混匀1min,常温条件下超声提取10min,于0℃~4℃条件下10000r/min离心5min,上清液转移至另一10mL聚丙烯离心管中,残渣中再加入5mL乙腈(3.1.2)重复提取一次,合并上清液,于40℃下氮吹至近干,再加入乙腈(3.1.2)至2mL,摇匀,待净化。4BJS2024135.2.1.2其他试样称取试样1g(精确至0.01g)于50mL聚丙烯离心管中,加入200μL混合内标工作液(3.4.5.3),加入1g氯化钠(3.1.4),再加入5mL乙腈(3.1.2),涡旋混匀1min,超声提取10min,于0℃~4℃条件下10000r/min离心5min,上清液转移至另一个50mL聚丙烯离心管中,残渣中再加入5mL乙腈(3.1.2),重复提取一次,合并上清液,加入10mL水,摇匀,—18℃及以下放置过夜(糖果、糕点、饼干、饮料无需冷冻过夜),取出后于4℃条件下10000r/min离心5min,取上清液待净化。5.2.2净化5.2.2.1食用植物油将提取液(5.2.1.1)加载至固相萃取柱(3.5.1)上,收集流出液于接收管中,摇匀,过0.22μm聚四氟乙烯滤膜(3.5.3),供测定。5.2.2.2其他试样将提取液(5.2.1.2)加载至固相萃取柱(3.5.2)上[使用前依次用10mL甲醇(3.1.1)及10mL水活化],弃去流出液,用5%甲醇溶液(3.2.2)5mL淋洗,弃去淋洗液,吹干柱体,用10.0mL甲醇(3.1.1)洗脱,收集洗脱液于接收管中,摇匀,过0.22μm聚四氟乙烯滤膜(3.5.3),供测定。5.3仪器参考条件5.3.1液相色谱参考条件5.3.1.1色谱柱:苯基硅烷键合硅胶色谱柱(2.1mm×150mm,5μm),或性能相当者。5.3.1.3进样量:5μL。5.3.1.4流速:0.4mL/min。5.3.1.5流动相:A为5mmol/L乙酸铵溶液(3.2.1),B为甲醇(3.1.1),梯度洗脱条件见表1。表1液相色谱梯度洗脱条件时间/min流动相A/%流动相B/%0653565957.45957.565351065355.3.2质谱参考条件5.3.2.1离子源:电喷雾离子源(ESI源)。5.3.2.2扫描方式:负离子扫描。5.3.2.3监测方式:多反应监测(MRM)。5.3.2.4雾化气(GS1)、气帘气(CUR)、辅助气(GS2)、碰撞气(CAD)均为高纯氮气或其他合适气体,使用前应调节至质谱灵敏度达到检测要求,参考条件详见附录B。5.3.2.5电喷雾电压(IS)、离子源温度(TEM)、碰撞能量(CE)、去簇电压(DP)等参数应优化至最佳灵5BJS202413敏度,监测离子对和定量离子对等信息见附录B。5.4标准曲线的制作将系列标准工作溶液(3.4.6)分别注入液相色谱-串联质谱仪中,测定相应的峰面积的响应值,以标准系列工作液中目标化合物的浓度为横坐标,以目标化合物峰面积的响应值与内标峰面积的响应值的比值为纵坐标,绘制标准曲线。大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚及其内标标准溶液的液相色谱-质谱/质谱多反应监测色谱图见附录C。5.5试样溶液的测定5.5.1定性测定在相同试验条件下,试样中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之内,将试样中被测组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较,若偏差不超过表2规定的范围,则可判定为试样中检出对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%>50>20~50>10~20≤10最大允许偏差/%±20±25±30±505.5.2定量测定将试样溶液(5.2)注入液相色谱-串联质谱仪中,得到相应的峰面积,根据标准曲线得到待测物的浓度。用标准工作曲线对试样进行定量,应使试样溶液被测物质的响应值在仪器测定的线性范围内,若被测物质含量超出标准曲线的测定范围,则应重新处理试样,适量减少称样量并相应增大内标添加量,用稀释的方式使最终上样溶液中内标浓度与标准溶液中内标浓度保持一致,使其上机浓度在线性范围内再进行定量。6结果计算试样中被测组分的含量按式(1)计算:m×1000X=c×V×f×1000(m×1000式中:X—试样中被测组分的含量,单位为微克每千克(μg/kg);c—由标准曲线得出的样液中被测组分的质量浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);V—溶剂的定容体积,单位为毫升(mL);f—稀释倍数;m—试样称取的质量,单位为克(g);1000—换算系数。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,计算结果保留三位有效数字。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的15%。6BJS2024138其他当取样量为1g时,大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚的检出限为20μg/kg,定量限为50μg/kg。9结果表述如样品配料表中含火麻仁或火麻仁加工品,使用本方法可测得试样中大麻酚、大麻二酚或四氢大麻酚的含量。其余情况,检出值超过50μg/kg时应结合执法证据综合研判。7BJS202413附录A(资料性)标准品及内标的中文名称、英文名称、CAS号、分子式和相对分子质量标准品及内标的中文名称、英文名称、CAS号、分子式和相对分子质量见表A.1。表A.1标准品及内标的中文名称、英文名称、CAS号、分子式和相对分子质量序号中文名称英文名称CAS号分子式相对分子质量1大麻酚Cannabinol521-35-7C21H26O2310.42大麻二酚Cannabidiol13956-29-1C21H30O2314.53四氢大麻酚Tetrahydrocannabinol1972-08-3C21H30O2314.54大麻酚-D3Cannabinol-D31435934-54-5C21H23D3O2313.45大麻二酚-D3Cannabidiol-D31435783-16-6C21H27D3O2317.56四氢大麻酚-D3Tetrahydrocannabinol-D381586-39-2C21H27D3O2317.58BJS202413附录B(资料性)质谱参考条件质谱参考条件如下。a)离子源:电喷雾离子源(ESI源)。b)扫描方式:负离子扫描。c)检测方式:多反应监测(MRM)。d)电喷雾电压(IS):—4500V(ESI—)。e)气帘气(CUR):68.95kpa。f)雾化气(GS1):310.26kpa。g)辅助气(GS2):310.26kpa。h)离子源温度(TEM):600℃。注:本附录所列质谱条件仅供参考,当采用不同质谱仪器时,仪器参数可能存在差异,测定前应将质谱参数优化到最佳。大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚标准品及其内标的监测离子对及质谱分析参数见表B.1。表B.1大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚标准品及其内标的监测离子对及质谱分析参数化合物名称保留时间/min母离子(m/≈)子离子(m/≈)去簇电压Dp/V碰撞能量CE/eV大麻酚—130—39—60大麻二酚4.91—120—32—26四氢大麻酚5.23—140—37—36大麻酚-D3—130—44大麻二酚-D34.91—100—31四氢大麻酚-D35.23—130—37*定量离子对。大麻二酚与四氢大麻酚为一对同分异构体,需注意两者的色谱分离,在该色谱条件下,大麻二酚、四氢大麻酚的保留时间分别为4.91min、5.23min。9BJS