细胞生物学第13章 细胞衰老与凋亡课件

细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡第十三章细胞凋亡与衰老●细胞凋亡(Apoptosis)●细胞衰老(cellularaging或cellsenescence)细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡机体结构细胞增殖细胞分化细胞凋亡细胞信号转导染色体（DNA与蛋白质的相互作用）衰老细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡一、细胞凋亡的概念及其生物学意义PRIZED

Branna,

Horvitz,andSulstonsharePhysiologyorMedicineNobel（2002）

“fortheirdiscoveriesconcerninggeneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath”1090–131=959(cells)细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡

1.概念细胞凋亡的概念最早是由病理学家Kerr于1972年正式提出的。细胞凋亡是一种具有特征形态和生化改变的细胞凋亡过程，这些改变是一系列基因活动引起的级联反应的结果。又被称为“细胞程序性死亡”（programmedcelldeath,PCD）细胞凋亡具有利他性。细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡2.研究历史（阶段划分）（1）细胞凋亡的形态学研究：1972年前，建立和形成细胞凋亡的概念（2）细胞凋亡的生物化学研究：DNA的特征性降解、蛋白质与RNA的合成、Ca2+浓度的变化、细胞凋亡的酶学研究（3）细胞凋亡的分子生物学研究：80年代后期，主要研究细胞凋亡过程中相关的基因以及细胞凋亡信号转导系统等细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡（1）

胚胎发育（2）

清除抗原激活的淋巴细胞（3）

清除癌变的细胞（4）

清除病毒感染的细胞（5）

防止炎症的产生（6）

细胞新陈更新的需要3.细胞调亡的生物学意义细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡

蝌蚪尾的消失细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡

脊椎动物神经系统的发育细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡发育过程中手和足的成形过程细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡（1）

AIDS：HIV诱导淋巴细胞凋亡（2）自身免疫疾病：激活的淋巴细胞凋亡缺陷（3）癌症：凋亡缺陷（4）老年痴呆/中风：过多神经细胞凋亡

4、细胞凋亡与疾病细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征坏死细胞(necrosis)凋亡细胞(apoptosis)细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡1.细胞凋亡与细胞坏死特征Apoptosisnecrosis诱导因素生理及弱刺激强烈刺激细胞数量单个细胞丢失成群细胞死亡膜完整性保持到晚期早期即丧失染色质凝聚成半月状稀疏成网状细胞核早期固缩断裂晚期破碎细胞器无明显变化肿胀、破损细胞内溶物无释放释放细胞形状形成凋亡小体破裂成碎片基因组DNA有控降解随机降解能量需求依赖ATP不依赖ATP大分子合成一般需要不需要后果不引起炎症引起炎症意义生理死亡方式病理死亡方式细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡细胞坏死与凋亡的形态区别细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡2.细胞凋亡的形态学特征细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡

左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞（注意凋亡小体）细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡3.细胞凋亡的生化特征细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker

（自赵允、翟中和）细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡4.诱导细胞凋亡的因子◆物理性因子包括射线（紫外线，

射线等）较温和的温度刺激（如热激，冷激）等◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂、激素、细胞生长因子、肿瘤坏死因子

（TNF

）、抗Fas/Apo-1/CD95抗体等细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡5.细胞凋亡的检测形态学技术琼脂糖电泳技术DNA片段原位标记法ELISACaspase-3活性的检测磷脂酰丝氨酸外翻分析细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡形态学技术1光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。

贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割

成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258),DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。DNA片段原位标记法细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡ELISA细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡Caspase-3活性的检测细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡磷脂酰丝氨酸外翻分析细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡三、细胞凋亡的分子调控机理●线虫(C.elegans)凋亡研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。Ced3哺乳类同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1。一只四龄(L4)的线虫(A.C.elegans)幼虫。可以看见红色的细胞核、蓝色的DNA与绿色的上皮细胞边缘。本照片由麻省理工Horvitz实验室提供细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡1.

Caspase家族与凋亡◆Caspase家族

Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡◆caspase超家族成员及其相应底物细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡

◆

Caspase活化Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化。Caspase8Pro-Caspase3ActiveCaspase3Pro-Caspase7ActiveCaspase7A．通过激活的Caspase-Caspase级联反应细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡

B．

通过诱导的“近域效应”（Proximity）

凋亡受体介导的细胞凋亡

DDFADDPro-Caspase8FasFasFas-LActiveCaspase8Apoptosis细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡

D、

通过与调节亚单位结合线粒体依赖的细胞凋亡

C、通过去除抑制因子：IAPCaspaseSmacIAPCaspaseSmacActive+CaspaseCascadeApoptosisDeathSignalsBADmitochondriaCytochromecApaf1Pro-Caspase9ActiveCaspase9细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡◆胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径

当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptorprotein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡。下游Caspases活化后，作用于底物，裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNALadder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡2.Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡◆Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；

Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；

Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3。细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡BCL-2家族成员细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡Bcl-2、线粒体与细胞凋亡◆当Caspase8活化后，它一方面作用Procaspase3，另一方面使Bid裂解成2个片段，其中含BH3结构域的C-端片段被运送到线粒体，与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成复合物，导致细胞色素C释放。CytC与胞质中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)结合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起细胞凋亡.细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡线粒体途径及其信号传递（1）γ射线或神经酰胺等

→破坏线粒体内电子传递和能量代谢

→细胞凋亡细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡

→细胞凋亡（2）释放Cas活化因子UX、Bax表达↑→细胞色素C释放cytochromeC与凋亡促进因子结合→Apaf-1分子构象改变

→结合pro-Cas-9→Cas-9活化→水解pro-Cas-3→Cas-3活化→细胞凋亡→呼吸链中断、ATP↓、氧自由基↑细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡释放DPF（deathpromotingfactor）

→激活pro-Cas-9

→激活Cas-3

*直接释放pro-Cas-3

→参与细胞凋亡信号传导释放氧自由基

*呼吸链将电子向分子氧传递

→产生氧自由基

→细胞不可逆损伤→凋亡（3）线粒体膜渗透性改变

→线粒体内高渗状态

→细胞骨架蛋白受压→凋亡细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡MitochondrionApoptoticStimuli(UVandg-irradiation;chemodrugs)Procaspase-9IAPProcaspase-3Caspase-3Caspase-8Procaspase-8Deathligand(Fas;Trail)DeathreceptortBidSmac/DiabloApoptosisCaspase-9细胞凋亡的分子机理细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡Anoverviewofthedeath-receptorpathwayandthemitochodrialpathway细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡二、细胞衰老(cellularaging或cellsenescence)什么是衰老？衰老又称老化，通常指生物发育成熟后，在正常情况下随着年龄的增加，机能减退，内环境稳定性下降，结构中心组分退行性，趋向死亡的不可逆现象。衰老发生在生物界的整体水平、种群水平、个体水平、细胞水平及分子水平等不同层次。细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡●Hayflick界限(HayflickLimitation）●细胞在体内条件下的衰老●衰老细胞结构的变化●细胞衰老的分子机理细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡1.

Hayflick界限(HayflickLimitation）●概念：细胞，至少是培养的细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是Hayflick界限.◆癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞.◆细胞的增殖能力与供体年龄有关.◆物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系.细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡细胞来源人胚肺成纤维细胞中年人成纤维细胞老年人成纤维细胞可增殖代数40-60202-4不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡2.细胞在体内条件下的衰老●在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生●正常情况下终生保持分裂的细胞，其分裂能力是否随着有机体年龄的增高而下降？它们会不会衰老？

◆衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长

◆衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老◆骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖速度也趋缓慢细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡3.衰老细胞结构的变化●细胞核的变化:体积增大，核膜内折、染色质固缩化●内质网的变化:衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了●线粒体的变化 ◆通常，细胞中线粒体的数量随年龄减少，而其体积则随年龄增大细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡3.衰老细胞结构的变化●致密体的生成●膜系统的变化

◆衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小

◆衰老细胞间间隙连接及膜内颗粒的分布也发生变化细胞生物学第13章细胞衰老与凋亡4.细胞衰老的分子机理●氧化性损伤学说－－－差错学