1.1基因工程的基本工具、DNA的粗提取和鉴定课件高二下学期生物苏教版（2019）选择性必修3

第三章基因工程第

1.1节基因工程的基本工具、DNA的粗提取和鉴定1970年发现逆转录酶分离出限制内切性核酸酶1967年发现质粒发现DNA连接酶1957年发现DNA聚合酶1973年将大肠杆菌不同质粒重组，并转化成功真核生物的基因可以在原核生物中进行表达1972年完成首次DNA分子体外重组1976年利用大肠杆菌制备生长激素释放抑制因子1977年首次对一种噬菌体完整基因组进行测序1990年人类基因组计划启动2003年测序完成

上述仅是按照时间顺序简要提及基因工程相关基础理论的突破和技术的创新。有些你已经学习过，更多的将在本章中展开。基因工程是在多学科基础上发展而来的基因工程的概念基因工程又称为DNA重组技术，是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。操作环境操作方法操作过程目的（人教版）基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。操作水平结果操作对象→基因原理→基因重组意义→定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍基因工程的基本工具能将目的基因连接到载体上能将目的基因导入受体细胞中DNA连接酶质粒等限制性内切核酸酶准确切割DNA分子，得到所需的目的基因“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”（1）“分子手术刀”——限制性内切核酸酶（又称限制酶）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的功能：能识别

DNA

分子上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开（1）“分子手术刀”——限制性内切核酸酶（又称限制酶）讨论：1.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？2.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？提示

含某种限制酶的细菌DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。提示

限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。5’5’3’3’5’3’3’5’（又称限制酶）EcoRI（在G与A之间切割）中轴线黏性末端SmaI（在G与C之间切割）平末端中轴线错位切平切（1）“分子手术刀”——限制性内切核酸酶5’—G3’—CCTAG判断①5’—T3’—ACTAG②5’—3’—CTAG③GATCC—3’G—5’GATCA—3’T—5’GATC—3’—5’④⑤⑥5’—TGATCA—3’3’—ACTAGT—5’5’—GATC—3’3’—CTAG—5’5’—GGATCC—3’3’—CCTAGG—5’下列6个DNA片段中，哪些片段是由同一限制酶切割得到的？注意说明（1）限制酶是一类酶而不是一种酶。（2）限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不是氢键。（3）限制酶具有特异性，任何一种限制酶都只能识别和切断特定核苷酸序列，这是由

酶的专一性所决定的。（4）限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，

少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列。（5）同一种限制酶切割形成的黏性末端一定相同，相同黏性末端也可能由不同限制酶

切割得到。（2）“分子缝合针”——DNA连接酶AGCCTGAGCCTG氢键TGACCGTGACCG磷酸二酯键磷酸二酯键（2）“分子缝合针”——DNA连接酶分布：广泛存在于各种生物体内作用：将被酶切的DNA片段拼接成新的DNA分子，在DNA复制、修复以及体内外重组过程中起着重要作用常用种类及作用：种类来源作用相同点E.coli

DNA

连接酶T4

DNA

连接酶大肠杆菌T4

噬菌体只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）恢复的都是磷酸二酯键拓展延伸DNA连接酶和DNA聚合酶的比较比较项目DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键不需要需要DNA的一条链作模板在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键只能将单个脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制作用：一是作为运载工具，与外源基因（即目的基因）的DNA片段结合，将目的基因转移到受体细胞中；二是在受体细胞内对目的基因进行大量的复制。常用的载体：质粒λ

噬菌体的衍生物动植物病毒等（3）“分子运输车”——基因进入受体细胞载体质粒的结构与特点：①质粒的结构：裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力②质粒的来源：质粒存在于细菌和酵母菌等生物细胞中，最常用的是大肠杆菌质粒③质粒的本质：环状DNA分子（3）“分子运输车”——基因进入受体细胞载体（3）“分子运输车”——基因进入受体细胞载体必须具备的条件：①在受体细胞中能保存下来并能大量复制；②有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入；③有标记基因，便于筛选含重组DNA的细胞；④对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。关键点拨标记基因的筛选原理

载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。归纳总结：基因工程的理论基础（1）不同生物的DNA分子能够拼接起来（2）外源基因能够在受体内表达，并使受体表现出相应性状①基本组成单位相同：都是四种脱氧核苷酸②双链DNA分子的空间结构相同：都是规则的双螺旋结构③DNA碱基对之间的关系相同：均遵循严格的碱基互补配对原则①基因的功能特点：是控制生物体性状的结构和功能单位，具有相对独立性②遗传信息的传递方向都遵循中心法则③生物界共用一套遗传密码DNA的粗提取与鉴定获得

DNA的基本过程：裂解细胞使核酸分子释放出来从释放出来的细胞成分中分离核酸分子纯化获得核酸分子DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。实验思路：DNA的粗提取与鉴定DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精初步分离DNA和蛋白质DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最小溶解DNA在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色鉴定DNA实验原理：DNA的粗提取与鉴定实验材料：（1）一般选取鸡血来提取DNA，鸡血中血细胞含量高，DNA含量丰富，材料易得，细胞易吸水涨破。也可以选用植物细胞如洋葱等，只是破碎植物细胞比较麻烦，提取洋葱DNA时，需先将洋葱切碎，然后加入一定量的洗涤剂和食盐，进行充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。（2）该实验中不能选用猪血处等哺乳动物的血，因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和各种细胞器。洗涤剂：溶解细胞膜、核膜，释放出细胞内含物食盐：使构成染色体的核蛋白加速解聚，游离出DNA分子，并使DNA

分子充分溶解于NaCl溶液中DNA的粗提取与鉴定实验步骤：制备鸡血细胞取质量浓度为0.1g·mL-1的柠檬酸钠溶液（防止血液凝固）100mL和新鲜鸡血180mL，注入500mL烧杯中，充分搅拌。将混合均匀的鸡血细胞液置于4℃冰箱内，静置一天，使血细胞沉淀。破碎细胞：取出准备好的鸡血细胞液5~10mL，注入50mL烧杯中，并向烧杯中加入20mL蒸馏水，搅拌5min；提取核内物质：用垫有纱布的漏斗过滤，取其滤液。破碎细胞，获取含DNA的滤液——DNA的粗提取DNA的粗提取与鉴定实验步骤：溶解细胞核内的DNA取物质的量浓度为2mol·L-1的NaCl溶液40mL加入滤液中，用玻璃棒沿同一方向轻轻搅拌，使其混合均匀，并过滤除去不溶的杂质。析出含DNA的黏稠物取适量蒸馏水沿烧杯壁缓缓加入滤液，同时用玻璃棒沿同一方向轻轻搅拌，观察烧杯中有无丝状物出现。当丝状物不再增加时，停止加入蒸馏水。用玻璃棒将丝状物挑起，这就是含有一定杂质的DNA——DNA的粗提取DNA的粗提取与鉴定——DNA的粗提取讨论：1.在DNA的粗提取中，两次加入蒸馏水的作用相同吗？2.DNA的粗提取完成后，如何进一步纯化上述含有杂质的DNA？提示

两次加入蒸馏水的目的不相同；第一次加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放出核物质，第二次加入的目的是稀释NaCl溶液，从而析出DNA。提示

向溶解有

DNA

和蛋白质的溶液中加入适量的、冷却的、体积分数为

95%

的乙醇溶液，溶液中会出现白色丝状物即

DNA，而部分蛋白质会溶解在乙醇溶液中，这样可以对

DNA

起到进一步的纯化作用