CN201510226911.0 - 一种藤梨根提取物及其在制备治疗胆管癌药物中的应用配方专利技术

(21)申请号201510226911.0(71)申请人中国医科大学附属盛京医院地址110004辽宁省沈阳市和平区三好街(72)发明人赵相轩卢再鸣郭启勇(74)专利代理机构沈阳亚泰专利商标代理有限公司21107代理人史力伏A61KA61P(54)发明名称一种藤梨根提取物及其在制备治疗胆管癌药物中的应用管癌细胞株QBC939和HCCC9810细胞作为研究对两条途径观察藤梨根提取物对人胆管癌细胞的生长抑制作用和凋亡诱导作用，结果表明：该藤梨根提取物对人胆管癌细胞活性，生长具有显著地抑制作用；能够强烈诱导胆管癌细胞凋亡；能够显著抑制胆管癌裸鼠移植肿瘤生长，显示出良好21.一种藤梨根提取物，是通过下述方法制备得到的：步骤1、取藤梨根片状药材，采用蒸馏水快速漂洗；然后采用70%酒精快速漂洗，风冷吹干蒸馏水和酒精；步骤2、采用高速粉碎机间歇式粉碎至特细颗粒，得藤梨根药材干粉；步骤3、精确称取藤梨根药材干粉，用95%乙醇室温浸泡24h,过滤，得藤梨根药渣；步骤4、所述藤梨根药渣采用75%乙醇室温浸泡24h,过滤，弃掉药渣，得藤梨根浸出步骤5、所述藤梨根浸出液采用水浴减压蒸馏浓缩，得浓缩浸出液；步骤6、所述浓缩浸出液4℃静置一周，待静置的浓缩浸出液自然分层后，吸取上层黑褐色液体；步骤7、所述黑褐色液体进行高速离心，去除不溶解的沉淀物；步骤8、采用移液器吸取上清液；步骤9、采用针头注射器使上清液通过0.22μm滤膜，然后分装到无菌EP管中，放入冰箱4℃保存，备用；2.如权利要求1所述的藤梨根提取物，其特征在于，所述步骤2中高速粉碎机的转数为3.如权利要求2所述的藤梨根提取物，其特征在于，所述步骤2中特细颗粒的粒度为300-500目。4.如权利要求3所述的藤梨根提取物，其特征在于，所述步骤2中间歇式粉碎为离心1min,停歇3-5min。5.如权利要求4所述的藤梨根提取物，其特征在于，所述步骤4中藤梨根浸出液4℃保6.如权利要求5所述的藤梨根提取物，其特征在于，所述步骤5中水浴温度为50℃。7.如权利要求6所述的藤梨根提取物，其特征在于，所述步骤7中黑褐色液体12000rpm高速离心30min。8.权利要求1所述的藤梨根提取物在制备治疗胆管癌药物中的应用。3技术领域结构的药物制剂技术领域，具体涉及双子叶植物纲的藤梨根；本发明是利用特殊工艺得到的藤梨根提取物，并在制备治疗胆管癌药物中的应用。背景技术[0002]胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，近年来，其发病率在全球范围内呈上升趋势。目前胆管癌的主要治疗手段是早期发现，进行手术切除。然而由于其恶性程度高，发病隐匿，大多数患者在确诊时已处于晚期，不适合手术切除。同时该胆管癌对目前现有的到对胆管癌更为有效的药物。[0003]中药是中华民族数千年来与疾病做斗争过程中形成和积累的宝贵资源，目前世界各国对中药抗肿瘤的机制进行了广泛的研究，从中草药得到提取物或者单体并开展肿瘤治疗的应用越来越多，并开始得到国内外的承认和重视。中药抗肿瘤机制有多方面，如抑制肿瘤血管形成、促进细胞凋亡、诱导细胞分化、调节机体免疫功能等。藤梨根为猕猴桃科植物风湿性关节炎、胃癌和乳腺癌等疾病的中草药，尤其对消化道肿瘤疗效较佳。近年来体内外实验研究发现，藤梨根制剂对多种肿瘤(如胃癌、结肠癌、食管癌、肺癌肿瘤细胞)表现出较好的抑制作用，可通过多种途径发挥抗肿瘤作用，其药理研究和临床验证受到广泛关注；而有关藤梨根提取物(RadixActinidiaExtractive,RAE)对胆管癌的作用研究尚未见报道。[0004]现有的提取工艺一般是采用水或有机溶剂进行浸提，然后通过乙酸乙酯和正丁醇萃取，再利用石油醚-丙酮，氯仿-甲醇或者聚酰胺进行洗脱，最后得到藤梨根提取物。这样的提取工艺的缺点是工艺繁杂，极易导致提取物中活性成分丢失或者失活而大大降低药发明内容[0005]本发明就是针对上述问题，弥补现有技术的不足，提供一种藤梨根提取物及其在制备治疗胆管癌药物中的应用。该藤梨根提取物对人胆管癌细胞活性，生长具有显著地抑制作用；能够强烈诱导胆管癌细胞凋亡；能够显著抑制胆管癌裸鼠移植肿瘤生长，显示出良好的抗胆管癌活性。[0006]为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案，即本发明提供的藤梨根提取物是通过下述方法制备得到的。冷吹干蒸馏水和酒精。[0008]步骤2、采用高速粉碎机间歇式粉碎至特细颗粒，得藤梨根药材干粉；所述间歇式粉碎为离心1min,停歇3-5min,使得粉碎机转头恢复至室温，方可再次启动进行粉碎；所述4高速粉碎机的转数为20000rpm-30000rpm,所述特细颗粒的粒度为300-500目。[0009]步骤3、精确称取藤梨根药材干粉，用95%乙醇室温浸泡24h,过滤，得藤梨根药渣。[0010]步骤4、所述藤梨根药渣采用75%乙醇室温浸泡24h,过滤，弃掉药渣，得藤梨根浸出液；所述藤梨根浸出液4℃保存。[0012]步骤6、所述浓缩浸出液4℃静置一周，待静置的浓缩浸出液自然分层后，吸取上层黑褐色液体。[0015]步骤9、采用针头注射器使上清液通过0.22μm滤膜，然后分装到无菌EP管中，放[0017]本发明还提供所述藤梨根提取物在制备治疗胆管癌药物中的应用。[0018]与现有技术相比本发明的有益效果。赖性；(2)RAE可以强烈诱导两种胆管癌细胞凋亡，有效激活细胞内的凋亡蛋白激酶，如Caspase3,Caspase8和PARP;(3)RAE能够显著抑制胆管癌抑制瘤在动物体内生长。综上所述，本发明制备的藤梨根提取物能够在体内、外显著抑制胆管癌细胞生长，并诱导其细胞凋亡，为治疗胆管癌临床药物的开发提供了新的方向。[0020]图1为本发明藤梨根提取物制备方法的流程图。抑制作用呈浓度梯度依赖性示意图。种抑制作用呈浓度梯度依赖性示意图。[0023]图4为RAE对QBC939胆管癌细胞具有强烈凋亡诱导作用的可见光显微镜细胞形态学变化图。[0024]图5为RAE对HCCC9810胆管癌细胞具有强烈凋亡诱导作用的可见光显微镜细胞形态学变化图。[0025]图6为RAE对QBC939胆管癌细胞具有强烈凋亡诱导作用的荧光显微镜细胞核染[0026]图7为RAE对HCCC9810胆管癌细胞具有强烈凋亡诱导作用的荧光显微镜细胞核染色图。[0027]图8为RAE对QBC939胆管癌细胞具有强烈的凋亡诱导作用的流式细胞仪定量检5[0028]图9为RAE对HCCC9810胆管癌细胞具有强烈的凋亡诱导作用的流式细胞仪定量[0030]图11为RAE对HCCC9810胆管癌细胞具有强烈的凋亡诱导作用的三次实验统计结[0031]图12为RAE对胆管癌细胞具有强烈的凋亡诱导作用的蛋白酶切割图。[0032]图13为RAE对胆管癌细胞裸鼠移植肿瘤具有明显的生长抑制作用的大鼠模型对[0033]图14为RAE对胆管癌细胞裸鼠移植肿瘤具有明显的生长抑制作用的移植肿瘤大[0034]图15为RAE对胆管癌细胞裸鼠移植肿瘤具有明显的生长抑制作用的肿瘤质量平均值对照图。具体实施方式[0035]请参阅图1,本实施例提供的藤梨根提取物是通过下述方法制备得到的。[0036]步骤1、取藤梨根片状药材，采用蒸馏水快速漂洗，去除药材表面灰尘和其他附着物；然后采用70%酒精快速漂洗，去除药材表面附着细菌及其他有害生物；风冷吹干蒸馏水[0037]步骤2、采用25000rpm高速粉碎机粉碎至300目颗粒，得藤梨根药材干粉；所述粉碎为间歇式粉碎，即离心1min,停歇3min,以避免温度高于50℃;使得粉碎机转头恢复至室温(25℃左右),方可再次启动进行粉碎。[0038]步骤3、精确称取500.00g藤梨根药材干粉，用2L95%乙醇室温浸泡24h,过滤，得藤梨根药渣。[0039]步骤4、所述藤梨根药渣采用75%乙醇室温浸泡24h,过滤，弃掉药渣，得藤梨根浸出液；所述藤梨根浸出液4℃保存。[0040]步骤5、所述藤梨根浸出液采用50℃水浴减压蒸馏，浓缩至50ml,得浓缩浸出液。[0041]步骤6、所述浓缩浸出液4℃静置一周，待静置的浓缩浸出液自然分层后，吸取上层黑褐色液体。[0042]步骤7、所述黑褐色液体进行12000rpm高速离心30min,去除不溶解的沉淀物。[0044]步骤9、采用针头注射器使上清液通过0.22μm滤膜，去除不溶解的微细颗粒和细菌等；然后分装到1.5ml无菌EP管中，放入冰箱4℃保存，备用。长期放置可导致白色析出[0045]步骤10、使用前恢复到室温25℃,即得藤梨根提取物。使用前恢复到室温25℃,可使长期放置导致的白色析出物重新溶解。[0046]本实施例还提供所述藤梨根提取物在制备治疗胆管癌药物中的应用。[0047]为进一步说明本发明的有益效果，以下提供临床前应用报告中的试验案例。6[0049]1.1细胞株：人胆管癌细胞株购于南京凯基生物公司。[0050]1.2主要药品及试剂：藤梨根片状药材(购于沈阳恒秋医药公司)。采用本实施例制备方法得到藤梨根提取物，使用时用DMEM培养基稀释成低浓度组(1.25mg/ml),中浓度组(2.5mg/ml)和高浓度组(5mg/ml);DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(Gibco公司);0.25%胰蛋白酶(HyClone公司);PBS(HyClone公司);DMSO(Sigma公司);MTS(Promega公司);Hoechst33342(碧云天生物科技公司);AnnexinV-FITC/PI(凯基生物公司);Caspase-3,Caspase-8,PARP(购自cellsignaling公司);ECL显色液(Thermo);脱脂奶粉(伊利);BSA(Promega);吐温缓冲液(Thermo);PVDF膜(Millipore)。[0051]1.3主要仪器及设备：超净工作台(江苏安泰空气技术有限公司，型号SW-CJ-2FD);二氧化碳培养箱(美国热电ThermoSci,型号371);低温离心机(德国Eppendorf,型号5340R);酶标仪(美国Biotek,型号SynergyH1);流式细胞仪(BD公司，型号ACurriC6);荧光显微镜(日本尼康，型号：TS100-F);紫外分光光度仪(德国Implen公司，型号P-330-31-10),电子天平(瑞士普利赛斯，型号EP220A)。[0052]1.4数据使用SPSS13.0进行处理，采用均数±标准差形式表示数据，组间比较采用单因素方差分析，*p<0.05认为差异具有统计学意义。[0054]2.1QBC939和HCCC9810两种[0056]①复苏：从液氮罐中取出冻存的QBC939胆管癌细胞，37℃水浴锅中晃动溶解后，将冻存管中的胆管癌细胞移至含5mlDMEM培养液的培养瓶中，吹打混匀，观察细胞悬浮均[0057]②传代：当细胞单层铺满瓶底时，将细胞从培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入3ml无菌磷酸盐缓冲液冲洗，加2ml0.25%胰酶消化3min,在倒置显微镜下观察被消化的细胞，待细胞变圆、脱落时，加入10ml培养液，吹打混匀成细胞悬液，胞悬液分装于两瓶培养瓶中，送回培养箱继续培养。实验时选用对数生长期细胞。[0058](2)HCCC9810胆管癌细胞的培养，具体步骤与上述QBC939胆管癌细胞的培养类[0059]2.2MTS法检测RAE对胆管癌细胞的增殖抑制作用。[0060]MTS实验是一种用比色法来检测细胞增殖的实验方法，MTS可被细胞生物还原成为一种有色的甲攒产物，可直接溶解于培养基中。这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中中的活细胞数成正比。因此MTS能够客观评价活细胞的生存和增殖的状况，是抗肿瘤药物筛选的重要检测途径。[0061]本实施例采用MTS法检测RAE对QBC939胆管癌细胞的增殖抑制作用，具体步骤如[0062](1)收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度为5×10⁴个/ml种入96孔板，每孔加入100μ1。[0063](2)培养24h使细胞贴壁。更换培养液后浓度梯度组分别加入1.25mg/ml、2.5mg/7ml、5mg/ml浓度的RAE处理细胞48h,同时设立对照组，每组设置3个复孔。[0064](3)处理结束后，取出96孔板，每孔加入20μ1MTS溶液，继续培养2h。[0065](4)取出后用酶标仪在490nm处测量各孔的吸光度值(OD值)。增殖存活率(100%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。该实验重复三次。[0066]本实施例采用MTS法检测RAE对HCCC9810胆管癌细胞的增殖抑制作用，具体步骤与上述胆管癌QBC939细胞类似，因此不再赘述。对胆管癌细胞增殖的抑制情况，发现各浓度组的RAE均可明显抑制QBC939和HCCC9810细[0068]2.3凋亡细胞形态学观察。[0069]取对数生长期胆管癌QBC939细胞，消化重悬为1×10⁵个/ml的单细胞悬液，每孔2ml接种于6孔细胞培养板中，培养24h待细胞贴壁。浓度梯度组分别加入含1.25mg/ml、[0070]本实施例中胆管癌HCCC9810细胞凋亡处理过程与上述胆管癌QBC939细胞类似，因此不再赘述。[0071]请参阅图4和图5,处理完毕后，先在可见光显微镜下分别进行两种胆管癌细胞形态观察，并分别拍摄照片。对照组细胞在可见光显微镜观察下，表现生长旺盛，贴壁伸展良好，细胞透光度好，无悬浮细胞。随着RAE浓度增加及作用时间延长，贴壁细胞密度逐渐箱内继续孵育15min后取出，在显微镜下观察细胞形态学变化及细胞核染色情况并拍照。请参阅图6和图7,Hoechst33342染色后在荧光显微镜下观察正常细胞核呈弥散均匀荧光，浓度梯度组细胞则表现为浓染致密的颗粒块状荧光，可见细胞凋亡的特征性形态改变出现(凋亡细胞的细胞核出现染色质凝集和片段化断裂)。[0072]综上，由图4-图7可见，RAE对QBC939和HCCC9810胆管癌细胞均具有强烈凋亡[0073]2.4流式细胞术检测细胞凋亡。[0074]细胞凋亡指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡及增殖异常是肿瘤发生的重要原因之一，诱导肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤药物发挥抗肿瘤作用的重要途径之一。流式细胞术是常用来检测细胞凋亡的实验方法，它可以鉴定细胞凋亡生化分子事件，以准确的进行凋亡细胞的计数并特异的定性分析和定量分析。[0075]本实施例采用流式细胞术检测胆管癌QBC939细胞凋亡，具体步骤如下。[0076](1)细胞分组：取对数生长期胆管癌QBC939细胞，消化重悬为1×10⁵个/ml的单细胞悬液，每孔2ml接种于6孔细胞培养板中，培养24h待细胞贴壁。浓度梯度组分别加入1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml浓度的RAE处理细胞48h,同时设立对照组，每组设置3个重[0077](2)收集细胞：收集所有细胞，2000转/min,4℃离心5min;弃上清留沉淀，加入1ml冷的PBS,轻轻震荡使细胞悬浊；2000转/min,4℃离心5min,弃上清；将细胞重悬于8500μ1BindingBuffer中；加入5μ1AnnexinV-FIFC,轻轻混匀，避光室温反应15min;加入5μ1PI,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。[0078]本实施例采用流式细胞术检测胆管癌HCCC9810细胞凋亡，具体步骤与上述胆管[0079]请参阅图8、图9、图10及图11,本实施例采用不同浓度的RAE分别作用于QBC939<0.05)。由此可见，RAE可显著诱导QBC939和HCCC9810胆管癌细胞发生凋亡。[0081]细胞凋亡是一个多基因参与的复杂的生命过程，Caspase8和Caspase3是凋亡信号传导中的关键效应分子。正常细胞中Caspase8和Caspase3以酶原形式存在于胞浆，细胞凋亡早期Caspase8被上游信号激活后可以激活下游的Caspase3,活化的Caspase3进而裂解下游蛋白底物PARP,将PARP剪切为2个片段，导致其失去DNA修复功能，诱发细胞凋[0082]本实施例采用免疫印迹法检测凋亡相关蛋白，具体步骤如下。[0083](1)收集蛋白样品。[0084]取对数生长期混悬均匀的QBC939细胞于培养瓶中，培养24h待细胞贴壁。弃旧培养液，浓度梯度组分别加入1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml浓度的RAE处理[0085]细胞刷刮取处理好的细胞，1000rpm离心5min后弃上清，PBS(磷酸盐缓冲液)清洗后加入细胞裂解液裂50μ1,冰上放置30min,12000r/min,4℃离心10min,收集上清(蛋[0086]考马斯亮蓝1:1000染色，分光光度仪测595nm的吸光值，根据测得结果配平蛋白[0087](2)电泳(Electrophoresis)。[0088]①SDS凝胶配制：层积胶及分离胶参考《分子克隆实验指南》相关章节进行[0089]②样品处理：在收集的蛋白样品中加入30μ16×loadingbuffer,100℃煮沸[0090]③上样与电泳：样品冷却到室温后，把蛋白样品上样到SDS胶加样孔内，每孔20μ1。[0091]样本在上层胶时使用60V电泳，进入下层胶时使用100V电泳。溴酚蓝到达胶的底端附近停止电泳。[0093]⑤洗膜：吐温缓冲液漂洗PVDF膜10min。[0094]⑥一抗孵育：参考一抗的说明书，按照适当比例稀释一抗。将PVDF膜置于相应稀释好的一抗，室温摇床上缓慢摇动孵育4h,或者4℃缓慢摇动孵育过夜。处理后加入吐温缓冲液，在摇床上缓慢摇动洗涤10min。[0095]⑦二抗孵育：参考二抗的说明书，用5%牛奶按照适当比例稀释二抗。将洗好的9PVDF膜置于相应稀释好的二抗，室温摇床上缓慢摇动孵育2h。处理完毕后加吐温缓冲液，在摇床上缓慢摇动洗涤20min。专用的压片暗盒压片，用显影液和定影液进行手工洗片。[0097]请参阅图12,随着RAE药物浓度增加，活化型Caspase-3、Caspase-8及剪切的PARP显著增加。本实施例的免疫印迹实验观察到活化型Caspase-3和剪切的PARP的表是细胞凋亡的外源性通路中的关键效应分子，活化的Caspase-8可激活下游Caspase-3等凋亡执行蛋白。免疫印迹实验结果中实验组活化型Caspase-8表达上调，由此推断RAE对QBC939细胞的凋亡诱导作用可能与外源性凋亡诱导通路有关。[0098]2.6体内实验。[0099]收集对数生长期的QBC939细胞，制成细胞悬液，每只鼠给予106个/100μ1细胞接予腹腔注射50mg/ml的RAE200μ1,对照组给予等量生理盐水。作用2周后，小鼠二氧化碳麻醉处死，体外观察肿瘤体积大小(肉眼直接观察皮下肿瘤大小),如图13所示。结果显示，RAE处理组肿瘤体积明显小于对照组。[0100]裸鼠腋下接种QBC939细胞，成瘤后随机分为两组，测量肿瘤大小差异无统计学意义。分别给与生理盐水和含RAE的生理盐水2周后，小鼠二氧化碳麻醉处死，肿瘤分别被取出后测量肿瘤大小，如图14所示，结果表明RAE处