在逆转EGFR-TKIs获得性耐药中的作用研究

PD0332991在逆转EGFR-TKIs获得性耐药中的作用研究

陈军天津市肺癌研究所天津医科大学总医院肺部肿瘤外科研究背景表皮生长因子受体（EGFR）是目前最为主要肺癌分子靶向治疗的靶点。EGFR-TKIs的耐药分原发性和获得性两类；获得性耐药的40-60％主要是由于EGFR基因的二次突变(T790M)和c-Met基因的扩增所引起；此外，旁路信号通路的激活，激酶的转换（KinaseSwitch）机理：如ERk，IGF－1R，PDGFR等高表达；本研究将主要集中在这40-50%无EGFR的二次突变（如T790M）和c-Met基因的扩增相关的获得性耐药机制上。研究材料EGFR野生型细胞株：A549，H460等，对TKI为原发性耐药；EGFR敏感突变细胞株：PC-9，HCC827等，对TKI高度敏感；从EGFR敏感突变细胞株建立的获得性耐药细胞株：PC-9/AB2，PC-9/AB11和PC-9/BB4等（本实验用）EGFR基因二次突变监测和分析（PCR+测序)细胞培养、筛选稳定的耐药株全基因组基因芯片分析microRNA芯片分析蛋白组学分析（2D+质谱）EGFR突变基因的逆转实验EGFR基因突变与吉非替尼治疗患者临床疗效分析阳性基因和蛋白的验证、鉴定（Real-TimePCR、Westernblot）评价靶基因在吉非替尼获得性耐药中的作用，探讨耐药机理，寻找新的治疗靶点并指导临床治疗阳性靶基因的表达情况与吉非替尼治疗患者临床特征分析（Real-TimePCR、免疫组化）靶基因的逆转实验应用基因转染和siRNA干扰技术，对已确定的在敏感株和耐药细胞株之间的差异的阳性靶基因进行干预。细胞周期（FACS）增殖（MTT）凋亡(FACS、TUNEL)不同细胞株间生物学特性的研究研究设计初步结果一、PC-9及其子系耐药株药物敏感度差异的研究CellsinhibitionratioswithIressaTypanBluestainingCountingMTTAssayCelllinesIC50（μmol/L）RIPC-90.0067±0.00341PC-9/AB21.56±0.285233±42PC-9/AB112.78±0.099415±14PC-9/BB41.75±0.082261±12P0.000.00IC50forPC9anditsderivedcelllinesbyMTTassay二、不同细胞株中EGFR基因突变和基因扩增检测和分析初步结果SequencingresultforthemutationofEGFRexons18-21

in

PC9cellsExon18

Exon19

Exon20Exon21PC9Wildtype15bpdeletionWildtypeWildtypePC9/AB2Wildtype15bpdeletionWildtypeWildtypePC9/AB11Wildtype15bpdeletionCAA→CAGWildtypePC9/BB4Wildtype15bpdeletionWildtypeWildtypePC-9PC-9/GPC9-AB2PC9-BB4PC9-AB11不同耐药细胞株中不存在EGFR的二次突变和c-Met基因扩增不同耐药细胞株中MET基因蛋白的表达无明显差异三、从基因表达角度探讨获得性耐药的产生机制：全基因组芯片分析

初步结果54675probesetsontheHumangenomeU133plus2microarrayPC-9vsPC-9/AB2PC-9vsPC-9/BB4PC-9vsPC-9/AB11SignalratioSignalratioSignalratio2249up-regulatedgenes725down-regulatedgenes1364up-regulatedgenes1807down-regulatedgenes1469up-regulatedgenes2289down-regulatedgenes509commonprobesetsGATHERgeneontologyanalysiscellmigration:7genes(p<0.0005)celladhesion:25genes(p<0.0005)G-proteincoupledreceptorproteinsignalingpathway:8genes（p=0.0007)High-levelgeneontologyKEGGpathwayanalysisECM-receptorinteraction：8genes(p<0.0005)Adherensjunction：7genes(p<0.005)值得关注的两点差异变化：在其中的100余个变化的基因都包含有转录因子E2F1的假定的结合位点，提示在耐药发生的过程中可能存在E2F1基因相关信号通路如Rb-E2F1的变化；血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)成员在PC-9子系耐药细胞株中的表达明显增高；

pathwaysgenesPvalueCellmigrationFN1,HMGCR,IL8,JAG1,LAMA4,NRP2,VEGFC0.00127celladhesionCD44CDH2COL4A6COL6A1COL6A2COL8A1ChGnFLRT2FN1IL8ITGA2ITGBL1LAMA4LAMC2MLLT4MSLNMUC4NEDD9NID2NRP2PROS1SPOCKTNFTSPAN2VCL0.00152G-proteincoupledreceptorproteinsignalingpathwayGNALGPRGPR109BGPR110GPR51GPRC5BIL8OXTR0.00737cholesterolbiosynthesisFDFT1FDPSHMGCRHMGCS10.008CellmotilityATP1A1FN1HMGCRIL8JAG1LAMA4NRP2SPOCKTM4SF6TSPAN2VEGFC0.008CellularprocessABATABCC2ACAA2ADRBK2ADSSL1AGPAT4AKR1C1AKR1C2ALDH3A1ANK3AQP3ARL7ARNTL2ATP1A1ATP2A3B3GALT3BFBHLHB3BIRC3C21orf66CCDC5CD44CDH2CEACAM6CHMCHURC1COL4A6

COL6A1COL6A2COL8A1CPMCPZCRIP1CTHCTSL2CTSOCYB5CYB561ChGnDIAPH2DIO2DNAH5DPP4DUSP13E2F1EHFEHMT1EMP2EPHA4EXT1EYA4FBLN1FBXO32FDFT1FDPSFGF18

FLRT2FMO5FN1FNBP1GALCGCNT2GDAGGTL3GLRBGLULGNALGPC4GPRGPR109BGPR110GPR51GPRC5BGPX2HECTD1HMGA2HMGCRHMGCS1HOXC13HSD3B1ICKIFI16IGFBP1IGFBP5IL8ING5INSIG1IRX3ITGA2ITGBL1KYNULAMA4LAMC2LATS2LEF1LEPRLHX2LOC115294LRP3LTBMAGI-3MAN1A1MAP3K1MAP3K8MAPK1MAPTMCCMEIS1METMETTL4MGAMGC47816MLLT4MORF4L2MSLNMUC4NCOA7NEDD4NEDD9NID2NPEPL1NPTX1NRP2OGTOXTRPAPOLAPEX6PIP5K1BPLCB4PLOD2PROS1PRSS11PTHLHPTPRMRAC1RARRES1RBM25RBM5RECQL5RESTRFKRFX5RREB1RRS1RTN2SALL2SATB1SCDSFRP1SLC12A8SLC1A1SLC1A4SLC1A6SLC22A1SLC2A3SLC2A4RGSLC4A7SLC7A7SLC8A1SMARCD3SNAG1SOD2SOX9SPOCKSRMSTMN3STXBP6SYBL1TIMP3TM4SF6TMEM23TNFTNFAIP3TNFAIP9TNFRSF11ATNFRSF9TNFSF15TNIKTNSTOP3ATPCN1TRIB2TSPAN2TUBB6UBE2D1UBE2J1UBTFUSP36VAPBVCLVEGFC0.01ECM-receptorinteractionCD44COL4A6COL6A1COL6A2FN1ITGA2LAMA4LAMC20.004AdherensjunctionLEF1MAPK1METMLLT4PTPRMRAC1VCL0.007四、Rb-E2F1相关的信号通路在EGFR-TKIs耐药中的作用研究E2F1siRNA干扰PC-9细胞后再用不同浓度的吉非替尼处理24h后细胞的增殖和凋亡变化情况。(A)细胞增殖分析(MTTAssay)；（B）细胞凋亡检测。E2F1沉默后明显增加了PC9细胞对易瑞沙的耐药性。E2F1，MET和Rb基因在PC-9及其子系耐药细胞株中蛋白表达情况GefitinibtreatmentreducedtheSphaseentryandDNAsynthesisinallcelllinesEGFinducedRb

PhosphorylationatSer780/ser795inPC9cellsβ-actinpRB780CDK6CDK4CYCLIND1pRB795

0’1h8h24h36h48hE2F1GefitinibDownregulatedEGFinducedRbPhosphorylationandReducedE2F1,CyclinD1,cdk4andcdk6inPC-9cellsβ-actinpRB780CDK6CDK4CYCLIND1pRB795

0’1h8h24h36h48hE2F1EGF引起Rb磷酸化，同时E2F1表达水平升高；吉非替尼抑制EGF引起的Rb磷酸化和E2F1水平的升高

推论与假设Rb-E2F信号通路在PC-9及其子系耐药细胞株中参与吉非替尼获得性耐药发生；即吉非替尼耐药的信号通路可能与Rb-E2F信号通路之间有相互交叉作用；由于吉非替尼的持续作用，可能导致Rb基因的磷酸化降低，E2F分子不能释放，使细胞不能顺利通过限速点R,进入S期，DNA复制不能顺利进行，从而导致进入G0期细胞的增多而发生对吉非替尼的获得性耐药；此时，可能旁路信号通路被激活，从而又导致了耐药细胞的增殖。

细胞进入S期并增殖CDK4CDK6cyclinD+RBE2F1E2F1GefitinibPI3K/AKTRAS/RAF/ERK/MAPK假设示意图五、PD0332991(acyclinDkinase4/6inhibitor)在EGFR-TKIs耐药中的作用研究PD不同肺癌细胞株的生物学特性的影响细胞活性