埃博拉出血热检疫技术规范

埃博拉出血热检疫技术规范26仪器和设备6.1PCR扩增仪。6.2荧光定量PCR仪。6.3水平电泳仪。6.4凝胶成像仪。6.5普通冰箱和-80℃冰箱。6.6低温冷冻离心机(可控温至4℃,离心速度可达12000g以上)。6.7二级生物安全柜。6.8高压灭菌锅。6.9微量可调移液器(2μL,10L,100L,1000L)及配套带滤芯吸头。7试剂和材料在检测中使用的试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682的一级水的要求。7.4三氯甲烷。7.5异丙醇：使用前-20℃预冷。7.7溴化乙锭(EB):10mg/mL,使用浓度为05temL.7.8TagDNA酵：-20℃保存。7.9dNTPs:含dCTP、dGTP、dATPdITTP各10mmolL的混合物，-20℃保存。7.10AMV逆转录酶：-20℃保存。7.11琼脂糖。7.12DNAMarker(100.-20006p)7.14上样缓冲液。7.152x荧光PCR预混液。8检验程序8.1样品采集、保存及运输样品的采集按照GB/T18088执行。样品温度应保持在0℃以下。样品的保存和运输的生物安全要求参照《病原微生物实验室生物安全管理条例》的有关要求执行8.2实验室检测组织样品先去除包膜和其他结绪组织，选取内部实质部分，置研钵中，加入石英砂充分研磨，然后按照1:5比例加入0.1mol/LPBS(pH7.6-pH7.8)。4℃浸泡过夜或者-20℃反复冻融2次，每次30min,4℃条件下以8000g离心5min,取上清进行后续操作。液体样品如血液、尿液、唾液不必经过研磨或冻融处理，直接进行后续操作。不能立即进行检测3时，样本冻存于-70℃左右超低温冰箱备用。8.2.2病毒核酸提取取灭菌的1.5mL离心管，做好标识。每管加入600μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL,再加人200pL三氧甲烷，紧盖离心管，混匀器上振荡混匀15s后室温静置5min,于4℃12000g离心15min。取新的灭菌的1.5mL离心管，加入-20℃预冷400L异丙醇，吸取离心后将各管中的上清液转移至预冷的异丙醇中，避免吸出中间层，颅倒混匀。于4℃12000g离心15min,弃上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，加入600μL75%预冷乙醇，颠倒洗涤。于4℃12000g离心10min,弃上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，室温干燥5min~10min。加入15μL~20μLDEPC水，溶解管底的RNA,5000g离心5s,冰上保存备用，若长期保存应放8.2.2.2核酸提取等效方法埃博拉病毒核酸提取也可以采用等效RNA提取试剂及方法，如采用商品化试剂盒或自动化核酸抽提仪和配套核酸抽提试剂进行核酸抽提。8.2.3阳性对照、阴性对照和空白对照检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为根据埃博拉病毒核苷酸序列通过基因合成、载体构建和体外转录合成的RNA.以及包含埃博拉病毒NP或GP基因的假病毒，阴性对照可选择其他类病毒的核酸样本，空自对照为无菌水作为扩增模板。8.2.4RT-PCR检测方法8.2.4.1检测引物上游引物NPF75-GAGTATGCTCCTTTCGC-3'下游引物NPR:5'-TTIGGTATTCGCCGTAG-3'GP基因扩增引物：上游引物GPF:5'-GCAACTGCGAAGAGGAG-3'下游引物GPR:5'-CACGGGTGTATTATGGCT-3'引物工作浓度均为10μmoVL,配制后于-20℃左右保存。扩增目的基因片段长度分别为NP基因538bp、GP基因396bp。RT-PCR扩增产物参考序列见附录C。在冰盒上配制20L逆转录反应体系。在0.2mL离心管中依次加入：DEPC处理水6.5μL,随机引物(25μmol/L)2μL,dNTPs照5μL。混匀，短暂离心，65℃保温5min后，冰上迅速冷却。然后在上述反应管中加人：5x逆转录酶缓冲液4μL,RNA酶抑制剂(40U/pL)0.5μL,AMV逆转录酶(200UpL)1μL。缓慢混匀。按以下程序进行cDNA合成：30℃10min,42℃45min;95℃5min灭活逆转录酶，冰上冷却。合成的cDNA可立即用于PCR扩增，或保存于-20℃备用。可采用同等逆转录效率的商品化逆转录试剂盒。4可采用同等逆转录效率的商品化一步法RT-PCR试剂盒。在PCR反应管中依次加人：去离子水33μL,10×TagDNA聚合酶缓冲液(不含Mg)5μLTagDNA聚合酶(5UHL正，合成的cDNA5μL。混匀，置于PCR仪中。按以下程序进行PCR扩增：95℃5min;(95℃1min,55℃1min,72℃1min)35个循环；72℃10min。8.2.4.4琼脂糖凝胶电泳用0.5×TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，加入适量的电泳核酸染料。分别取5μLPCR扩增产物与1pL6×载样缓冲液混匀后加入样品孔，使用DL2000DNA分子量标准物作为电泳参照。置于水平电泳仪上5V/cm电泳，当载样缓冲液中溴酚蓝指示剂色带迁移至琼脂糖凝胶的2/3处时停止电泳，用凝胶成像仪观察扩增结果。8.2.4.5结果判定用凝胶成像系统分析，NP基因阳性对照扩增出一条大小为538bp的特异性条带，GP基因阳性对照扩增出一条大小为396bp的特异性条带，阴性对照和空白对照无特异性条带；在阴性对照和阳性对照成立的情况下，如被检样品无条带，则结果为阴性，如被检样品有条带，且与阳性对照一致大小，即判定为埃博拉病毒核酸阳性。对于检测阳性的样本可切下电泳分析的目的条带，用凝胶回收试剂盒回收纯化(按其说明书进行),进行测序确认病毒基因序列。8.2.5实时荧光RT-PCR方法8.2.5.1引物和探针用于检测NP基因的弓物和探针：上游引物NP-FQ:S'-TTCCCTTTCCAGGACCCATC-3'下游引物NP-RQ:5-TCGGGAATCGTCGTATCCTG-3°探针NP-P:5'-FAM-CCTGGCCATCAAGATGATGATCCGAC用于检测GP基因的引物和探针：上游引物GP-FQ:5'-AGCTGTATCAAACCGACCCA-3°下游引物GP-RQ:5'-CTCGTGGAGATTGTGGCAAG-3'探针GP-P:5'-FAM-CGCGCCGGACTCTGACCACT-BHQi-3'引物和探针的工作浓度均为10μmol/L,配制后于-20℃左右保存。实时荧光RT-PCR扩增产物参考序列见附录D。8.2.5.3实时荧光PCR采用20μL反应体系：荧光PCR预混液(2x)10μL,探针0.6L,上、下游引物各0.4μL,cDNA模板1L,RNasefreeH₂O补足20pL。反应程序：95℃预变性5min,95℃变性10s,58℃530s,40个循环。每个循环结束时进行荧光信号的采集。检测结束后，根据收集的荧光曲线和C值判定结果。8.2.5.4结果判定及报告本方法检验结果判定及报告如下。——检测样本有明显的荧光增幅曲线，且C值≤35时，判为阳性，报告“检出埃博拉病毒核酸(实时荧光RT-PCR法。——检测样本荧光增幅曲线的C值介于35和40之间时，应重复进行试验，若重新检测的Ct值仍介于35和40之间。且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告“检出埃博拉病毒核酸(实时荧光RT-PCR法；否则判为阴性，报告“未检出埃博拉病毒核酸(实时荧光RT-PCR法”。——检测样本荧光增幅曲线的C值介于40和45之间时，可采用膜过滤法浓缩核酸样本，再重新进行实时荧光RT-PCR检测。若重新检测的Ct值有明显减少趋势。且曲线有明显的对数增长期。判为阳性，报告“检出埃博拉病毒核酸(实时荧光RT-PCR法)。此类样本建议采用其他方法进一步验证；否则判为阴性，报告“未检出埃博拉病毒核酸(实时荧光RT-PCR法”。埃博拉出血热埃博拉出血热(Eholahaemorhagicfever,EHF)是一种人兽共患病，是由丝状病毒科的埃博拉病毒(Eholavius,EBOV)导致人和非人灵长类动物(如猩猩和猴子)发生急性感染的烈性出血性传染病，人感染后死亡率高达50%-90%。A2传染源及宿主动物hat),尤其是活跃在撒哈拉以南的非洲(包括几内亚)的3类水果蝙蝠——无尾肩章果蝠(Epomopsfrangueri)、锤头果蝠(Hypsignathusmonstosus)和小领果蝠(Myonycteristoryurta)被认为是埃博拉病毒可能的自然宿主。受病毒感染的果蝠通过直接或间接的方式与其他动物接触来散播病毒，导致人类和非人灵长类动物如大猩猩、黑猩猩、恒河猴、猕猴的大规模流行。有研究发现在中非仓鼠和尖鼠体内检测到埃博拉病毒核酸，标志着啮齿类动物也有可能是储存宿主。另外，猪和犬是至今为止确定能感染埃博拉病毒的家畜。此外，有报道来自非洲热带丛林中的森林玲羊和豪猪感染埃博拉出血热情况。潜在媒介调查中，在节肢动物包括臭虫、半翅类昆虫等体内未检测发现有埃博拉病毒。A.3临床症状早期症状为起病急，突然高热、极度乏力则烈头痛、咽喉痛，全身肌肉和关节疼痛，可能还有寒颤和精神萎靡等。随后可出现严重的度内疼痛、恶心、吐逆和泻肚等消化系统病状。发病4d-5d后进入极期，患者主要表现为持续高烧。全身感染中毒症候和消化道病症更加严重，并伴有不同水平的出血现象，包含口鼻、结膜，肠胃、阴道和肌肤等部位出血，也见呕血和血尿等，多数患者可在面、颈、躯干和手臂等部位出现弥漫性红斑样丘疹，这是区别于其他类似疾病的症状。特重者可出现意识窒碍(如谵妄、嗒顺)、休克、多器官衰竭及致死性并发症等。A.4病理变化埃博拉