人肝前体细胞 征求意见稿

3T/XXXXXXX—XXXX人肝前体细胞本文件规定了人肝前体细胞制备的原材料和辅料、制备的一般要求、技术要求、检验方法、检验规则、标签、包装、储存及运输和废弃物处理要求。本文件适用于人肝前体细胞的制备和检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》（2020年版）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19815离心机安全要求GB/T26497电子天平YY/T0588流式细胞仪JJF1665流式细胞仪校准规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1人肝前体细胞由肝细胞在特殊条件下转化而得，可再次分化为肝细胞，在肝再生过程中起到重要作用的一类细胞。3.2主细胞库由细胞种子经培养至特定倍增水平或传代水平，并经一次制备获得并分装的同质和均一的悬液。注：细胞种子是指已通过鉴定证明适用于生物制品生产或检测的，来传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养以及基因工程构建的3.3工作细胞库由主细胞库的细胞经培养至特定倍增水平或传代水平，并经一次制备获得的同质和均一的悬液。4缩略语下列缩略语适用于本文件。FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）ALB：白蛋白（Albumin）AFP：甲胎蛋白（Alpha-Fetoprotein）ASGR1：去唾液酸糖蛋白受体1（AsialoglycoproteinReceptor1）CD：分化簇（ClusterofDifferentiation）CFSE：羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CarboxyfluoresceinSuccinimidylEster)ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）FGF7：肝前体细胞生长因子7（FibroblastGrowthFactor7）HGF:肝细胞生长因子（HepatocyteGrowthFactor）HLA-DR,DP,DQ：人白细胞抗原DR,DP,DQ（HumanLeukocyteAntigen-DR,DP,DQ）HNF4α：肝细胞核因子4α（HepatocyteNuclearFactor4Alpha）4T/XXXXXXX—XXXXIL-2：白介素-2（Interleukin-2）MMP1:基质金属蛋白酶-1（MatrixMetalloproteinase-1）MMP2:基质金属蛋白酶-2（MatrixMetalloproteinase-2）PBMC：外周血单核细胞（PeripheralBloodMononuclearCells）PHA：植物血凝素（Phytohemagglutinin）LAC：白细胞活化混合液（LeukocyteActivationCocktail）Fix/PermKit：固定/通透化试剂盒（Fixation/PermeabilizationSolutionKit）RPMA：反相蛋白质微阵列技术（ReversePhaseProteinMicroarray）TNF-α：肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisFactor-alpha）5原材料和辅料5.1起始原材料的获取应符合伦理和法律法规，起始原材料供者应签署书面的合法有效的知情同意书，并建立起始原材料数据库，保护供者隐私信息。5.2应建立和执行供者评估及筛选方法，供者应至少筛查HBV、HCV、HIV、TP，检测结果应均为阴性,注：HBV为乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）的缩写，HCV为丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）的缩写，HIV为人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyViru5.3应排除有遗传性疾病的供者，并应对供者进行一般情况筛查。5.4应建立和执行组织或细胞的采集、运输、交接与储存方法。5.5细胞培养过程中使用的培养基及其他添加物等应建立质量标准，并按照质量标准进行控制。5.6不宜使用动物血清或其他动物源成分，如必须使用，应确认无特定动物源性病毒感染。5.7细胞冻存时使用的辅料，应建立质量标准，并按照质量标准进行控制。6制备的一般要求6.1人肝前体细胞培养所需的基础设施和环境条件，应符合GMP要求，满足产品质量控制需要的洁净条件并避免微生物污染和交叉污染。注：GMP为GoodManufacturingPractice，即为良好生产规范，是一质量标准进行生产和控制的系统化准则。其核心目标是通过严格的流程控制确保产品6.2制备方应对制备操作人员进行培训，建立考核标准，人员培训考核合格后进行制备操作。6.3制备方宜建立人肝前体细胞的主细胞库和工作细胞库。6.4人肝前体细胞应长期冻存于低于-130℃的环境下，并有相应的冻存记录，至少包含细胞名称、培养代次、冻存密度、冻存体积、冻存时间等信息。6.5人肝前体细胞的制备应有标准操作规程，制备过程应符合标准操作规程的要求。6.6人肝前体细胞培养或使用时，应记录细胞名称、培养代次、细胞密度与细胞活率等信息。6.7人肝前体细胞培养或使用时，细胞代次不应超过18代。7技术要求人肝前体细胞应符合表1中的技术要求。表1人肝前体细胞计数要求AFP、CD34、CD45、ASGR1阳性比例均应不大于2.5T/XXXXXXX—XXXXHLA-DR,DP,DQ阳性比例应不大于2染色体核型应为46，XY或者46，XX。8检验方法8.1细胞形态体外培养，二维贴壁培养条件下，用显微镜进行细胞形态观察。8.2细胞标志蛋白按照附录B细胞标志蛋白检测进行试验。8.3细胞存活率按照附录A细胞存活率检测进行试验。8.4可溶性因子分泌水平（MMP1）按照附录C细胞功能指标检测进行试验。8.5可溶性因子分泌水平（MMP2）按照附录C细胞功能指标检测进行试验。8.6可溶性因子分泌水平（HGF）按照附录C细胞功能指标检测进行试验。8.7可溶性因子分泌水平（FGF7）按照附录C细胞功能指标检测进行试验。8.8免疫原性按照附录B细胞标志蛋白检测进行试验。8.9淋巴细胞增殖效力按照附录D免疫调控检测进行试验。8.10PBMC分泌TNF-α能力按照附录D免疫调控检测进行试验。8.11无菌检查按照中华人民共和国药典（2020年版）四部通则1101无菌检查法进行试验。8.12支原体检查按照中华人民共和国药典（2020年版）四部通则3301支原体检查法进行试验。8.13细胞内毒素检查按照中华人民共和国药典（2020年版）四部通则1143细菌内毒素检查法进行试验。6T/XXXXXXX—XXXX8.14染色体核型按照中华人民共和国药典（2020年版）三部生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制要求进行试验。8.15成瘤性按照附录E人肝前体细胞成瘤性检测进行试验。9检验规则9.1抽样方法9.1.1在一个制备周期中，同一供体来源、同一制备线、同一代次、同一天收获、同一方法制备出来的产品为一批。9.1.2在同一批中，每个检测类别随机抽取1个此批次最小包装单元进行检验。9.2检验9.2.1每批产品应进行出厂检验，并附检验报告。9.2.2出厂检验应涵盖第7章的全部项目。9.3判定规则使用符合第5章要求的原材料和辅料、制备过程符合第6章要求，且出厂检验项目全部符合第7章的技术要求时，判为合格品；有1项及以上不符合要求时，判为不合格品。10标签人肝前体细胞产品应在包装上的规定位置上标注，标注内容至少应包括名称、细胞代次、细胞数量、制备批号、储存条件、制备日期等内容。11包装、储存及运输11.1包装应选择对人肝前体细胞关键质量属性无影响的材料和容器。11.2储存11.2.1应选择不影响细胞质量性状的细胞冻存液、细胞保护液及其他液体。11.2.2应在低于-130℃的环境下长期储存。11.3运输11.3.1应根据细胞的使用要求，选择合适的承运机构。承运机构应具备相应的功能单元，如质量体系、人员、设备监控及调度等。11.3.2冻存的细胞应在低于-130℃条件下运输，非冻存细胞应在2℃~8℃条件下运输。细胞运输时的介质，如细胞冻存液、细胞保护液及其他液体，应能保证细胞活性。12废弃物处理12.1人肝前体细胞制备和检测过程中产生的废弃物，应有完善的废弃物暂存、运输记录，应选择有资质的承运废弃物机构。12.2人肝前体细胞制备和检测过程中不合格的细胞、剩余废弃的细胞或组织，应灭菌/灭活后，进行合法并符合伦理的处理。7T/XXXXXXX—XXXX细胞存活率检测细胞计数法A.1仪器和设备A.1.1荧光细胞分析仪荧光细胞分析仪应按照JJF1665要求进行仪器校准。A.2试剂A.2.1除另有说明外，所有试剂均为分析纯，检测用水应为符合GB/T6682要求的一级水。A.2.2磷酸盐缓冲液：市售，pH值应为7.2～7.4。A.2.3AO/PI染液：市售，吖啶橙和碘化丙锭染料。A.3检测步骤A.3.1细胞悬液制备收集待检测细胞，用磷酸盐缓冲液（A.2.2）配置细胞悬液，细胞悬液终浓度宜在1×106个细胞/mL到1×107个细胞/mL之间。A.3.2细胞染色按1：1的体积比将AO/PI染液（A.2.3）与细胞悬液（A.3.1）混合均匀。A.3.3细胞计数取混合好染料的样品（A.3.2），上样至计数板进行检测,每个样品需2个复孔检测。在仪器面板上输入实验名称，样品编号，选择细胞直径参数（12～24μm），输入稀释比例，读取总细胞密度、活细胞密度和活率。A.3.4计算与分析细胞存活率“%”、活细胞浓度“个细胞/mL”以及总细胞浓度“个细胞/mL为仪器直接读取。A.3.5精密度在重复性条件下进行两次独立测定，两次测定结果的绝对误差应不超过其算术平均值的10%。·8T/XXXXXXX—XXXX细胞标志蛋白及免疫原性检测流式细胞法B.1仪器和设备B.1.1流式细胞仪流式细胞仪应遵循YY/T0588要求，具有红色、蓝色发射光，配备所使用的荧光通道相应的带通滤B.1.2水平离心机水平离心机应遵循GB19815标准。B.1.3电子天平显示分度值0.1mg，电子天平应遵循GB/T26497标准。B.2试剂B.2.1除另有说明外，所有试剂均为分析纯，检测用水均为符合GB/T6682要求的一级水。B.2.2磷酸盐缓冲液，市售，pH值应为7.2～7.4。B.2.3抗人ALB、HNF4α、CD44、CD90、AFP、CD34、CD45、ASGR1、HLA-DR,DP,DQ抗体及同型对照抗体。B.2.4固定液：含有4%多聚甲醛的组织固定液，于2℃~8℃保存。B.2.5穿膜液：用磷酸盐缓冲液配制，体积比为0.5%曲拉通X-100缓冲液，或者购买穿膜液，于2℃~8℃保存。B.2.6封闭液：用磷酸盐缓冲液配制含0.3mol/L甘氨酸的，体积比为10%羊血清缓冲液，或者购买封闭液，于2℃~8℃保存。B.2.7洗涤液：磷酸盐缓冲液，于2℃~8℃保存。B.3样品保存标记后的样品于2℃~8℃避光保存。B.4检测步骤B.4.1样品准备收集细胞，用水平离心机（B.1.2）500×g，离心3min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液洗涤一遍样品，再用水平离心机（B.1.2）500×g，离心3min，弃去上清液。B.4.2抗体孵育B.4.2.1细胞表面标志物抗体孵育选择细胞标志蛋白对应的抗体及同型对照抗体，按照供应商提供的抗体说明书稀释抗体，抗体与细胞悬液混匀后，于2℃~8℃孵育30～60min。孵育结束后，用洗涤液（B.2.7）清洗样品两遍，用水平离心机（B.1.2）500×g，离心3min，弃去上清液。B.4.2.2细胞胞内标志物抗体孵育样品中加入1mL固定液（B.2.4）重悬沉淀细胞，室温固定30min后，用水平离心机（B.1.2）500×g，离心3min，弃去上清液。9T/XXXXXXX—XXXX样品中加入1mL穿膜液（B.2.5），重悬沉淀细胞，室温孵育30min后，用水平离心机（B.1.2）500×g，离心3min，弃去上清液。样品中加入1mL封闭液（B.2.6）重悬沉淀细胞，室温孵育30min后，用水平离心机（B.1.2）500×g，离心3min，弃去上清液。选择细胞标志蛋白对应的抗体及同型对照（若有按照说明书稀释抗体，抗体与细胞悬液混匀后，37℃避光孵育30min。孵育结束后用洗涤液（B.2.7）清洗1～2遍，用水平离心机（B.1.2）500×g，离心3min，弃去上清B.4.3过滤上机用洗涤液重悬细胞，使用流式细胞仪（B.1.1）上机检测。B.4.4圈门设定B.4.4.1根据细胞大小和颗粒度设门圈出目标细胞分群（即cells排除细胞碎片和多细胞聚团，如B.4.4.2同型对照抗体组作为阴性对照，根据其荧光强度，在分群cells的基础上画出细胞群singlecells，排除没有被荧光抗体标记的阴性细胞和粘连细胞，如图B.1中B。B.4.4.3在分群singlecells的基础上显示具体细胞标志蛋白的阳性比例，如图B.1中C。图B.1圈门示意图T/XXXXXXX—XXXX细胞功能指标检测ELISA法C.1仪器和设备多功能酶标仪，应可以进行试剂盒推荐的波长检测。C.2试剂MMP1检测试剂盒、MMP2检测试剂盒、HGF检测试剂盒、FGF7检测试剂盒。C.3样品保存C.3.1实验组为培养人肝前体细胞3天的培养上清液，保存于-60℃~-80℃。C.3.2对照组为人肝前体细胞培养用培养基，保存于2℃~8℃。C.4检测步骤C.4.1样品准备收集不少于2mL的培养人肝前体细胞3天的培养上清液，放入离心管中，用水平离心机（B.1.2）300×g，离心10min，取上清液，保存于-60℃~-80℃。C.4.2样品检测C.4.2.1按试剂盒操作说明将标准品稀释至推荐的标准曲线使用浓度，样品稀释至推荐比例。C.4.2.2将稀释后的标准品和样品加入试剂盒提供的检测板内并孵育一抗。C.4.2.3一抗孵育完成后清洗检测板，去除残留洗涤液。C.4.2.4孵育带标签的二抗。C.4.2.5孵育完成后清洗检测板，去除残留洗涤液。C.4.2.6检测板内加入显色剂，充分反应。C.4.2.7根据试剂盒操作说明中推荐检测波长，使用多功能酶标仪（C.1）进行检测。C.4.3计算根据标准曲线获得的样品浓度与酶标仪读数换算公式，将样品的酶标仪读数带入公式计算，得到对应的样品浓度。T/XXXXXXX—XXXX免疫调控检测流式细胞法D.1仪器和设备D.1.1荧光细胞分析仪荧光细胞分析仪应按照JJF1665要求进行仪器校准。D.1.2流式细胞仪流式细胞仪应遵循YY/T0588要求。D.1.3水平离心机水平离心机应遵循GB19815标准。D.2试剂D.2.1除另有说明外，所有试剂均为分析纯，检测用水均为符合GB/T6682要求的一级水。D.2.2磷酸盐缓冲液：市售，pH值应为7.2～7.4。D.2.3消化酶：市售，应为重组蛋白酶。D.2.4AO/PI染色液：市售，吖啶橙和碘化丙锭染料。D.2.5FBS：市售，应含多种细胞生长所需的因子，对细胞的增殖和代谢具有支持作用。D.2.6RPMI1640完全培养基：移取1mLFBS加入8.99mLRPMI1640培养基中，充分混匀。D.2.7IL-2：市售，活性应满足不低于1×107U/mg。D.2.8PHA：市售。D.2.9CFSE：市售。D.2.10TNF-α：市售，应为抗人单克隆抗体。D.2.11LAC：市售。D.2.12Fix/PermKit：市售。D.3淋巴细胞增殖效率检测步骤D.3.1将人肝前体细胞接种于24孔细胞培养板，贴壁培养16h～24h。D.3.2第二天将PBMC复苏，并进行细胞计数。按照CFSE试剂盒说明书推荐进行染色，染色结束后使用添加了IL-2、PHA的活化的RPMI1640完全培养基进行重悬。D.3.3取出培养16h～24h的人肝前体细胞，弃掉孔里培养基，加入染色、活化后的PBMC细胞共培养3~4天。D.3.4同时接种染色、活化后的PBMC细胞用作阳性对照；染色、未活化的PBMC细胞作为阴性对照；接种活化但未染色的PBMC细胞作为空白对照培养3～4天。D.3.5流式上机：将培养的细胞混匀取出于流式管中，用水平离心机（D.1.3）500×g，离心5min，弃去上清液；用磷酸盐缓冲液（D.2.2）洗涤一遍样品，再用水平离心机（D.1.3）机500×g，离心5min，弃去上清液，用用磷酸盐缓冲液（D.2.2）重悬上机。D.3.6数据分析：根据细胞大小和颗粒度设门圈出目标细胞排除细胞碎片和多细胞聚团；根据根据阴性对照和空白对照圈出目的细胞的增殖信号。D.4PBMC分泌TNF-α能力检测步骤D.4.1将人肝前体细胞接种于24孔板贴壁培养一天。T/XXXXXXX—XXXXD.4.2第二天将PBMC复苏进行细胞计数，按照CFSE试剂盒说明书推荐进行染色。D.4.3取出培养一天的人肝前体细胞，弃掉孔里培养基，加入染色后的PBMC细胞共培养1天。D.4.4同时加入染色后的PBMC两孔分别用作阳性对照和同型对照。D.4.5第三天加入LAC刺激3h～6h，结束后使用Fix/PermKit将PBMC进行固定、破膜，再加入抗人TNF-α抗体及其同型对照于2℃~8℃孵育30min。D.4.6流式上机：将孵育结束后的细胞混匀取出于流式管中，用水平离心机（D.1.3）机500×g，离心5min，弃去上清液；用磷酸盐缓冲液（D.2.2）洗涤一遍样品，再用水平离心机（D.1.3）机500×g，离心5min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液（D.2.2）重悬上机。D.4.7数据分析：根据细胞大小和颗粒度设门圈出目标细胞分群1，排除细胞碎片和多细胞聚团。D.4.8根据同型对照圈出目的细胞阳性区域。D.5计算结果按公式（D.1和D.2）进行计算，正值为促进率，负值为抑制率。D.5.1PBMC增殖抑制检测计算公式式中：X——促进率/抑制率，%；Y1——供试品CFSE阳性结果，%；Y0——阳性对照CFSE阳性结果，%。D.5.2PBM