动物实验技术基本技能训练项目五实验动物样本采集与处理活体采血技术任务一大小鼠眼眶后静脉丛采血与尾尖

动物实验技术基本技能训练主讲人：王千慧，刘金鹏（佰昊生物）项目五实验动物样本采集与处理——活体采血技术任务一大/小鼠眼眶后静脉丛采血与尾尖采血技能训练思前想后基本技能项目一实验动物伦理与福项目二实验动物抓取、保定与编号、标记外因→“输入”项目三实验动物经口给药技术项目四实验动物注射给药技术“输出”→分析项目五实验动物活体采血技术项目六实验动物安死术与解剖、取材人类血液样本检查实验动物疾病检查与早筛；健康状况评估；检测药物治疗效果；监测药物治疗效果；研究与科学研究...实验动物血液的采集不同的实验动物采血的用途血量的大小血液的质量。。。采血方式的选择了解受检血液样本的种类与差异，明确血液样本品质的重要性；了解颌下静脉采血、隐静脉采血、心脏采血等方法应用范围、优势、劣势的基础上，重点掌握心脏采血在明确大/小鼠眼眶后静脉丛采血与尾尖采血应用范围、采血量、操作要领与注意事项；知识目标：任务目标能安全、独立、熟练运用眼眶后静脉丛与尾尖采血方法为完成对大/小鼠的采血；掌握血涂片制备方法，能正确使用显微镜进行涂片观察；能制备高品质血清并掌握其保存方法；技能目标：爱护实验动物，在尽可能降低动物伤害的基础上，能根据具体动物种类、实验需求，选择合理、合适的采血方式，为未来综合性动物实验项目的设计与实施奠定基础。素质目标：一、认识“全血”、“血浆”与“血清”全血包括血细胞和血浆的所有成分；采集全血时，收集管中必须含有抗凝剂；常用的抗凝剂有：肝素、柠檬酸钠和乙二胺乙酸酸(EDTA)，应根据不同研究需要进行选择。01血浆是全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，获得的不含细胞成分的液体；含有纤维蛋白原、凝血因子等。02血清是全血未经过抗凝处理，血凝块聚缩释出的液体；其中没有纤维蛋白原和凝血因子；分离血浆和血清的一般方法是：2000-3000rpm离心15min以上。03一、认识“全血”、“血浆”与“血清”正常的血清或者血浆样本为黄色清液，而若为偏红，即为有红细胞破裂而产生溶血现象血后由于细胞内外物质的转移、光学干扰、与试剂成分发生化学反应等机制对检验结果产生不同程度的干扰，导致多个临床生化免疫项目测定结果假性降低或升高影响血液样本品质的关键因素——溶血现象04如何避免溶血现象的发生？1.采血时要避免小鼠毛发、油脂沾染血液导致溶血，所用的容器、注射器必须清洁干燥，不能有水或者有机溶剂；2.抽血时速度不要太快，速度太快会有气泡产生；3.抽出的血放入试管时，要先拔掉针头再放血，同时速度不要太快；4.收集分离血清的全血时应尽量使血液直接进入小管底部，避免管壁或管盖上的血液在离心过程中导致溶血。应注意以下的事项：二、大/小鼠常见采血方式（1）适用于少量、多次采血；（2）一般可采集血量为0.1-0.2mL，所采集血液为动静脉混合血；（3）从动物福利角度出发鼠尾采血应优先选择用于需血量较少的连续多次采血，如血常规或血糖的动态监测等。1.大/小鼠鼠尾采血法二、大/小鼠常见采血方式（1）适用于需中等量血液、避免小鼠死亡的血液指标连续监测；（2）采血法方法简单，便于掌握，采血成功率高，大/小鼠死亡率低，血流较快，采血量中等，小鼠约可采血0.2-0.3ml，大鼠约可采血0.4-0.6ml2.大/小鼠眼眶后静脉丛采血法二、大/小鼠常见采血方式（1）适用于需中等量血液、避免小鼠死亡的血液指标连续监测；（2）大/小鼠损伤小，采血所需时间很短；可反复采血，每次采血量约0.2-0.5ml；操作方便，无需麻醉；采血后动物恢复快；符合3R原则；（3）缺点：血液由下颌部被毛处流出,有可能粘连上毛发污染血液；（4）注意事项：需要熟练掌握找下颌静脉的位置；确保其头部和前肢不能摆动，防止血液洒落；注射针头的大小、进针的力度和深度要依照小鼠体重而定。3、颌下静脉采血二、大/小鼠常见采血方式（1）所需血量少的连续多次采血；药代动力学研究，以及生化指标和血液计数的检测；（2）因其静脉位置表浅，穿刺准确性较高；无需麻醉，消除了麻醉剂对实验结果的影响；（3）需剃毛、暴露采血点；取血量少，每次约0.02-0.1ml。4、隐静脉采血二、大/小鼠常见采血方式应用：适用于需血量大的实验终末期的动物采血；血常规、免疫、各种生化指标。优点：无菌采血，抽血快，血液不易凝集，采血量大，小鼠采血量0.5-0.8ml，大鼠采血量1-1.5ml。缺点：操作难度较大，但进针角度和深度不好把握，新手失败率高；心脏小，心率快，采血比较困难,可引起心包出血以及心包填塞致小鼠死亡；开胸直视采血容易剪破心脏大血管；需要麻醉。注意：此法要求实验者掌握以下要点：要迅速而直接插入心脏，否则，心脏将从针尖处滑脱；如第一次没刺准，将针头抽出重刺，不要在心脏周围乱探，以免损伤心、肺；要缓慢而稳定的抽吸，否则，太多的真空反而使心脏塌陷。5、心脏采血（非必需勿用）二、大/小鼠常见采血方式（1）适用实验终末期采血，可采集血量0.8-1.2mL；（2）动物麻醉后，解剖暴露腹主动脉的方式采集血液，取血量大、不易溶血，适用于多项目检测，不损伤器官，不会出现因操作不当造成气栓与瘀血等，有利于病理组织学检查。6.腹主动脉采血二、大/小鼠常见采血方式方法适宜动物采血量(mL)血液类理采血次数溶血操作损伤眼眶后静脉丛采血小鼠0.2-0.3静脉血可多次较多易较小大鼠0.4-0.6尾静脉采血小鼠0.1-0.15静脉血可多次较多较难较小大鼠0.1-0.2尾尖采血小鼠0.1-0.2动脉血+静脉血可多次较多较易较小大鼠0.3-0.5颌下静脉采血小鼠0.2-0.5静脉血可多次较少较易较小心脏采血小鼠0.5-0.8动脉血/静脉血不可多次较少较易较大大鼠1-1.8颈动(静)脉采血小鼠0.3-0.5动脉血/静脉血可多次较少较易较小大鼠0.3-2隐静脉采血(后肢)小鼠0.02-0.1静脉血可多次较少较易较小大鼠0.5-0.6腹主动脉采血小鼠0.8-1.2动脉血不可多次较少较易较大大鼠1-2股动(静)脉采血小鼠0.3-0.5动脉血/静脉血可多次较少较易较小大鼠0.3-2摘眼球采血小鼠0.2-0.3动脉血+静脉血不可多次较少较易较大大鼠0.5-1断头采血小鼠0.5-1.0动脉血+静脉血不可多次较少较易大三、大/小鼠尾尖采血与眼眶后静脉丛采血技能训练实验动物：昆明小鼠（每组6只）、SD大鼠（每组2只）雌雄各半；实验试剂与耗材：0.5mm/1.0mm毛细管，酒精棉球，干棉球，EP管；实验仪器：显微镜（一）实验所需试剂、耗材三、大/小鼠尾尖采血与眼眶后静脉丛采血技能训练1.应用：所需血量少的连续多次采血，如血糖或血常规的动态检测；注意流出的第一滴血可拭去；2.优点：操作较简单，动物不致死，可多次重复采血；3.缺点：取血量太少，约0.1ml，采血速度慢，不适于样本大和需要较多血量的小鼠实验；按摩鼠尾时可能会增加溶血的风险，易污染。（二）大/小鼠尾尖采血技术三、大/小鼠尾尖采血与眼眶后静脉丛采血技能训练4.操作流程与注意事项（1）固定动物并取出鼠尾，将鼠尾在45-50℃温水中浸泡数分钟，也涂擦酒精等，使局新血管扩张；（2）擦干尾部，用酒精棉球消毒鼠尾，用无菌手术刀、刀片或锋利的剪刀，快速截断小鼠尾尖约1-2mm，可以从尾部向尾尖方向按摩，以增加血流（注意，此方法降低血样的质量，增加溶血的风险），用毛细采血管收集血液，或直接滴入收集管中；（3）采血结束后，用干棉球按压伤口来止血。（二）大/小鼠尾尖采血技术三、大/小鼠尾尖采血与眼眶后静脉丛采血技能训练小鼠眼眶后静脉丛大鼠眼眶后静脉丛眼眶后静脉丛采血是一种较为常用的采血方式，适用于需中等量血液、避免小鼠死亡的血液指标连续监测。（三）大/小鼠眼眶后静脉丛采血技术三、大/小鼠尾尖采血与眼眶后静脉丛采血技能训练1.优点：眼眶后静脉丛采血法方法简单，便于掌握，采血成功率高，小鼠死亡率低，血流较快，采血量中等，小鼠约可采血0.2-0.3ml，大鼠约可采血0.4-0.6ml；2.缺点：采血后需要一段时间的组织修复过程，否则会对采血量产生一定影响；不能采集到无菌的血样，血液中可能混有眼窝内的组织液和腺体分泌物，对于血样要求较高的研究，应谨慎使用；易损伤眼球，易感染，造成失明；3.注意：多次建议左右两眼轮换取血。（三）大/小鼠眼眶后静脉丛采血技术三、大/小鼠尾尖采血与眼眶后静脉丛采血技能训练4.操作流程与注意事项实验操作前，需认真准备、检查实验动物、采血所需耗材；小鼠采用直径为0.5mm的毛细管；大鼠采用直径为1mm的毛细管；（三）大/小鼠眼眶后静脉丛采血技术1.将折断成2-3断；根据实验要求，选择是否浸泡肝素钠等抗凝试剂，控干备用；2.单手保定大/小鼠，将小鼠置于动物台上，用左手拇指和食指压迫小鼠颈背部皮肤同时向后提拉（注意避免用力过度压迫气管），此时使眼球外突，促进眼眶后静脉丛充血；3.右手持毛细管，置于内侧眼角处，以与鼻翼平面成30-45°，沿内眦刺入内眼角，滑入眼球后方，向眼底方向刺入；4.当感到阻力时即停止推进，轻轻旋转毛细管切割大/小鼠眼眶后静脉丛，即有血液流出；5.采血结束后，立即松开手指对大/小鼠的压迫，使眼球复位，同时拔出毛细管；可用干棉球压住眼眶进行止血6.将实验动物放回笼中，整理、收拾实验台面。三、大/小鼠尾尖采血与眼眶后静脉丛采血技能训练应注意毛细管刺入力度；采集血液时可将动物倒置、适度挤压动物胸部，加速血液流出；01采血时注意毛细管刺入深度，一般小鼠刺入2-3mm，大鼠刺入4-5mm即可；02若刺入位置后若仍未出血，可稍微前后移动毛细管，至血液流出；03平稳而熟练的操作可以减轻动物采血的痛苦；采血后注意观察动物状态，妥善处理实验动物。04三、大/小鼠尾尖采血与眼眶后静脉丛采血技能训练以小组为单位，完成大/小鼠染色法与标记法的操作训练；01录制并与学习通平台操作视频，”找茬纠错“对比提升；02通过查阅“实验动