药品微生物检验技术 课件 模块二 项目五 细菌内毒素检查

《药品微生物检验技术》模块二药品安全性检查项目五细菌内毒素检查

任务一鲎试剂的灵敏度复核试验

任务二碳酸氢钠注射液的干扰试验

任务三

碳酸氢钠注射液中细菌内毒素的检查

目录项目五细菌内毒素检查任务一鲎试剂的灵敏度复核试验

任务引入请思考

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。鲎试剂是从鲎（见图2-5-1）的血液中提取出的冻干试剂，可以与细菌内毒素发生凝集反应。某企业近期新采购了一批鲎试剂，根据《中国药典》2020年版要求，在对供试品进行细菌内毒素检查之前，首先要进行鲎试剂灵敏度复核试验。那么，鲎试剂灵敏度复核试验什么时候要做，什么时候可以省略不做呢？

任务分析当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。鲎试剂复核后才可以使用，以后使用同批次鲎试剂可不进行复核。本任务的工作内容及要求见表2-5-1。相关知识取细菌内毒素国家标准品或工作标准品1支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮药品微生物检验技术在瓶颈上部轻轻划痕，用75%乙醇擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。一、细菌内毒素标准溶液的制备

根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将标准品用细菌内毒素检查用水溶解，用封口膜将瓶口封严，放置在旋涡混合器上混匀15min或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作，然后制成２λ、λ、0.5λ和0.25λ４个浓度的细菌内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30s或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作。相关知识取0.1mL/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，用75%乙醇擦拭后启开备用，应防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1mL检查用水，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，溶解过程中应避免产生气泡。若待复核鲎试剂规格不是0.1mL/支时，取若干支按标示量加入细菌内毒素检查用水溶解，充分混匀后每0.1mL分装到1支试管中，至少分装18支管备用。二、待复核鲎试剂的准备

相关知识将已充分溶解的待复核鲎试剂18支管放在试管架上，排成5列，取不同浓度（即2λ、λ、0.5λ和0.25λ）的细菌内毒素标准溶液，分别与等体积（0.1mL）的鲎试剂溶液混合，每一个内毒素浓度行做4管；另外取2管加入等体积的细菌内毒素检查用水作为阴性对照。加样结束后，将试管中溶液轻轻振动混匀，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃的试管恒温仪中，保温60min±2min。三、加样试管恒温仪相关知识将试管从试管恒温仪中轻轻取出，缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（+）。保温和拿取试管过程应避免振动，防止造成假阴性结果。四、结果观察与记录当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。五、结果计算式中，Ｘ为反应终点浓度的对数值（lg），反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；ｎ为每个浓度的平行管数，即4。相关知识λc在0.5λ～２λ（包括0.5λ和2λ）时，判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰试验和供试品细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。六、结果判断任务实施一、制订工作计划序号工作内容完成时间成员负责人1玻璃器皿的洗涤与灭菌2细菌内毒素标准溶液的制备3待复核鲎试剂的准备4加样、观察与记录5结果计算与判断根据任务要求，制定合理工作进度计划，并根据小组成员的特点进行分工。任务实施二、试验前准备设备、器材、试剂规格数量用途电热干燥箱去除外源性内毒素水银温度计或酒精温度计测量温度旋涡混合器混合细菌内毒素标准品稀释溶液鲎试剂供试品细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品制备细菌内毒素标准溶液细菌内毒素检查用水稀释细菌内毒素标准品、鲎试剂移液管、无热原吸头、试管（１０ｍｍ×７５ｍｍ）、烧杯、试管架、洗耳球、计时器、７５％乙醇、棉球、剪刀、砂轮、铝箔等用于试验任务实施三、试验操作

根据鲎试剂灵敏度复核试验的具体操作步骤进行操作，按照表2-5-4填写鲎试剂灵敏度复核试验记录。任务测评项目五细菌内毒素检查任务二碳酸氢钠注射液的干扰试验任务引入请思考

碳酸氢钠注射液为无色澄明液体，主要用于治疗代谢性酸中毒和胃酸过多引起的症状，也可用于碱化尿液。为了减少不良反应，确保用药安全，需要建立碳酸氢钠注射液的细菌内毒素检查方法，还须进行干扰试验。那么，如何进行干扰试验呢？

某企业生产了一批碳酸氢钠注射液，依据《中国药典》2020年版通则1143，在对碳酸氢钠注射液进行细菌内毒素检查之前，须进行干扰试验，以建立碳酸氢钠注射液细菌内毒素检查的常规方法。

任务分析

干扰试验是比较鲎试剂与内毒素的反应在水溶液中和在供试品中进行的差异，即比较本反应在不同介质中进行的差异，有差异就表示供试品对反应存在干扰作用。

当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。相关知识

预试验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度（当供试品细菌内毒素限值以EU/mg或EU/U表示）或最小不干扰稀释倍数（当供试品细菌内毒素限值以EU/mL表示），为正式干扰试验提供依据。一、干扰预试验相关知识【举例】设某注射液细菌内毒素限值为2.5EU/mL，按MVD＝cL/λ计算出灵敏度为0.03EU/mL下的MVD为约80倍，将供试品溶液稀释一系列浓度梯度进行检验，用灵敏度为0.25EU/mL的鲎试剂进行预试验。结果如下：一、干扰预试验相关知识二、干扰试验制备细菌内毒素标准溶液制备含内毒素的供试品溶液鲎试剂的准备加样结果计算干扰排除相关知识二、干扰试验【举例】某注射液预试验中初步确定其最小不干扰稀释倍数为20倍，使用灵敏度为0.125EU/mL的鲎试剂检测供试品是否对内毒素检查存在干扰，结果如下：相关知识二、干扰试验【举例】某注射液预试验中初步确定其最小不干扰稀释倍数为20倍，使用灵敏度为0.125EU/mL的鲎试剂检测供试品是否对内毒素检查存在干扰，结果如下：任务实施一、制订工作计划任务实施二、试验前准备任务实施三、试验操作1.干扰预试验2.干扰试验3.结果取一批供试品进行干扰预试验，以得出无干扰稀释倍数。如果该稀释倍数下还存在干扰，继续扩大稀释倍数，选择更高灵敏度的鲎试剂进行试验。若试验不存在干扰，则选择相对应灵敏度的鲎试剂或更高灵敏度的鲎试剂进行干扰试验。取3个批号供试品进行干扰试验，3批供试品的试验结果ES均应在0.5λ～2.0λ范围内，包括0.5λ和2.0λ；ET均应在0.5ES～2.0ES范围内，包括0.5ES和2.0ES。确认结果，记录于书上表2-5-10。任务测评考核内容考核标准配分得分干扰预试验供试品的稀释能正确操作供试品的稀释5

试验观察能认真观察试验，并准确记录试验现象5

结果判断能正确进行试验结果判断10

干扰试验制备内毒素标准对照溶液能正确制备内毒素标准对照溶液5

制备含内毒素的供试品溶液能按要求制备并稀释标准溶液10

鲎试剂的准备能正确开启鲎试剂5

能按要求溶解鲎试剂5

加样与观察能按要求完成加样的操作10

能按要求记录试验观察结果10

结果计算与判断能准确计算试验结果10

能正确进行实验结果判断10

能准确填写试验结果记录表10

清场能按要求完成实验室的清场5

合计100

项目五细菌内毒素检查任务三碳酸氢钠注射液中细菌内毒素的检查

任务引入请思考某制药企业生产了一批碳酸氢钠注射液，质量检验部门需要对该注射液进行细菌内毒素检查。

依据《中国药典》2020年版，药品中细菌内毒素检查的方法是什么？凝胶限度试验对供试品进行细菌内毒素检查的具体操作步骤是什么？任务分析供试品进行细菌内毒素检查时，需要根据供试品的内毒素限量选择合适效价的鲎试剂。《中国药典》2020年版规定，在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次试验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。相关知识供试品的抽取同热原检查。一、供试品抽取二、供试品的处理某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲液调节pH值。酸、碱溶液或缓冲液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。所用溶剂，酸、碱溶液及缓冲液应不含内毒素和干扰因素。任务实施-碳酸氢钠注射液中细菌内毒素的检查一、制订工作计划任务实施-碳酸氢钠注射液中细菌内毒素的检查二、试验前准备任务实施-碳酸氢钠注射液中细菌内毒素的检查三、凝胶限度试验操作1.操作方法供试品溶液配制供试品阳性对照溶液制备阳性对照溶液制备阴性对照溶液制备加样、观察与记录任务实施-碳酸氢钠注射液中细菌内毒素的检查三、凝胶限度试验操作2.结果判断若阴性对照溶液Ｄ的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液Ｂ的平行管均为阳性，阳性对照溶液Ｃ的平行管均为阳性，试验有效。若溶液Ａ的两支平行管均为阴性，判定供试品符合规定。若溶液Ａ的两支平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液Ａ的两支平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，应进行复试。复试时溶液Ａ须做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定，否则判定供试品不符合规定。若供试品的稀释倍数小于最大有效稀释倍数而溶液Ａ结果不符合规定时，可将供试品稀释至最大有效稀释倍数重新试验，再对结果进行判断。任务实施-碳酸氢钠注射液中细菌内毒素的检查三、凝胶限度试验操作2.结果判断任务实施-碳酸氢钠注射液中细菌内毒素的检查三、凝胶限度试验操作2.结果判断任务测评考核内容考核标准配分得分供试品溶液的配制能正确吸取细菌内毒素检查用水5

能按要求配制供试品溶液10

阳性