T-CVMA 203-2024 牛冠状病毒感染诊断技术

中国兽医协会发布I1牛冠状病毒感染诊断技术NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4缩略语ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay)HRP：辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase)MEM：最低必需培养基（Minimumessentialmedium)PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphatebufferedsalRNA：核糖核酸（RibonucleicacRT-PCR：反转录聚合酶链式反应（ReversetranscTMB：四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethyl-benzi5病毒学26.1.2患病牛和带毒牛是本病的主要6.1.3主要通过消化道和呼吸道传播，也可通过接6.2.2成年牛冬季血痢主要见于产后成年奶牛，一般在冬季较为严重，特点是出现自限性水样腹发，并伴有出血性腹泻、频繁的呼吸症状、产奶量和奶品质下降，病情严重可道综合征。成年牛冬季血痢在诊断时要注意和牛病毒性腹泻、球虫和沙门氏菌引起的腹泻相区别。37.2.1活畜可采集鼻咽拭子和肛门拭子，要求可见明显黏液。发生腹泻的牛可将拭子伸入肛7.3.1用无菌剪刀和镊子采集病死牛部分气管和肺、肠道、淋巴结等组织，或一小段小肠及8.1.2冰箱（2℃~8℃、-20℃和-70℃)。8.1.3CO2培养箱（37℃)。4），9.1.2台式高速冷冻离心机。9.1.5紫外凝胶成像仪。9.1.6各种规格的移液器、离心管和PCR9.2.1RNA提取试剂：Trizol，或商品化RNA提取试9.2.2RT-PCR相关试剂：采用一步法，可选择商品化的One-stepRT-P59.3操作程序核酸。RNA提取应保证无细菌及核酸污染，置-70℃以下保9.3.3反应体系配制：采用25µL反应体系，扩增体b）两步法：在冰盒上配制反应体系，取9.3.2节中的下游引物（10μmol/L）、9.3.1节提按反转录试剂盒使用说明书配制反转录体系；获得cDNA后配制PCR扩增体系，包括cDNA29.3.4扩增程序：将PCR扩增管盖盖灭活15min，获得cDNA，再进行PCR扩增，程序为95℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环；72°C延伸10min，4°C保存扩增产9.4结果判定9.4.1阳性对照出现255bp左右的扩增条带，阴性对照无扩增条带，），牛冠状病毒核酸阳性；检测样品未出现目的片段，判为牛冠6参考GenBank收录的BCoVAKS-01株（KU886219）N基因序列，设计BCoV荧光定量RT-PCR引物被检样品Ct值＜36，出现典型S形扩增曲线，判为11.2.4PBS缓冲液、PBST洗涤液、包被液711.3.3封闭：每孔加入200µL5%的山羊血清（封闭液）进行封闭，置于37℃温箱内作用2h。11.1.1试验成立条件：阳性对照血清的平均OD450＞0.26，阴性对11.1.2判定：待检血清的OD450nm值≥0.256判为阳性，待检血清的OD450nm值＜0.256判为阳性。10章（荧光RT-PCR）任一项检测出BCoV核酸阳性的，可判定为牛冠状病毒感染。8A.1细胞培养液500µLA.2细胞维持液500µLA.3PBS缓冲液Na2HPO4KH2PO40.27gA.4PBST缓冲液NaClNa2HPO4KH2PO4加入去离子水约800mL，充分搅拌溶解，调节pH至7.4，定容至1L，高压灭菌A.5包被液Na2CO31.5NaHCO32.93gA.6封闭液A.7终止液H2SO421