T-SATA 076-2024 血清中37 种游离氨基酸的测定 高效液相色谱-串联质谱法

ICS03.080.99CCSX00血清中37种游离氨基酸的测定Determinationof37freeaminoacidsinserum——HighperformanceliquidchromatographytandemmasssIT/SATA076—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4原理 25试剂与材料 26仪器和设备 37分析步骤 38结果计算 49灵敏度、精密度 5附录A（资料性）37种游离氨基酸标准品信息 6附录B（资料性）37种游离氨基酸及内标物保留时间、定量定性离子对及碰撞电压、去簇电压 7附录C（资料性）37种游离氨基酸及13种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图 附录D（资料性）37种游离氨基酸的检出限、定量限 参考文献 T/SATA076—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由深圳市计量质量检测研究院提出。本文件由深圳市分析测试协会归口。本文件起草单位：深圳市计量质量检测研究院、深圳市药品检验研究院、深圳深检集团医学检验实验室、深圳市龙岗中心医院、四川大学、南方科技大学医院、深圳市人民医院、广州中医药大学深圳医院（福田）、深圳市龙岗妇幼保健院、深圳恒生医院。本文件主要起草人：李子樱、赵云霞、肖伟敏、孙亮、杨国武、李美芳、金一宝、陈欣、张玉鑫、叶新玉、陈佳平、王奇、罗敏、于建渤、李博、李小峰、李永新、袁小澎、赵洪悦、纪昕、于波海、周珍文、张光辉。1T/SATA076—2024血清中37种游离氨基酸的测定高效液相色谱-串联质谱法本文件规定了血清中37种游离氨基酸（3-甲基组氨酸、α-氨基己二酸、丙氨酸、L-鹅肌肽、精氨酸、精氨琥珀酸、天冬酰胺、天冬氨酸、β-氨基异丁酸、β-丙氨酸、L-肌肽、瓜氨酸、胱硫醚、胱氨酸、乙醇胺、γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、高瓜氨酸、同型半胱氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、O-磷酸乙醇胺、苯丙氨酸、脯氨酸、肌氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸）的高效液相色谱-串联质谱检测方法，包括试剂配制、样品制备、仪器检测、数据分析等内容。本文件适用于利用高效液相色谱-串联质谱法检测血清中37种游离氨基酸。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T32465-2015化学分析方法验证确认和内部质量控制要求WS/T225-2024临床化学检验血液标本的采集与处理；WS/T478-2024血清25-羟基维生素D2和D3的检测同位素稀释液相色谱串联质谱法WS/T661静脉血液标本采集指南；WS/T408-2024定量检验程序分析性能验证指南3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1内标internalstandard在定量分析时，加入到样品中作为参比物的已知量的化合物纯品。3.2检出限limitofdetection检测方法在规定的实验条件下所能检出分析物的最低浓度。3.3定量限limitofquantification在满足实验室对准确性和精密度要求的前提下，检测方法在规定的实验条件下所能准确定量检测分析物的最低可测量浓度或量。3.4线性linearity在给定的测量范围内，使测定结果与样品中分析物的量直接成比例的能力。此处的测定结果指最终的分析结果，而非仪器输岀的原始信号。3.5线性范围linearrange使实验系统的最终分析结果为可接受的线性的浓度范围，此时非线性误差应低于允许误差。2T/SATA076—20243.6基质效应matrixeffect标本中除分析物之外的样品性质对分析物测定结果的影响。4原理本标准建立的37种游离氨基酸检测方法以磺基水杨酸沉淀蛋白为原理，通过与游离氨基酸形成稳定的络合物，在酸性条件下通过沉淀的方式将络合物分离出来，最终得到单个的游离氨基酸后，用高效液相色谱-串联质谱测定，通过建立的标准品工作曲线以37种游离氨基酸与各自内标峰面积比计算血清37种游离氨基酸浓度。5试剂与材料除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。5.1试剂5.1.1乙腈（C2H3N）：质谱纯。5.1.2甲酸（CH2O2）：色谱纯。5.1.3磺基水杨酸（C7H6O6S）：分析纯，CAS号：5965-83-3。5.2试剂配制5.2.10.10%甲酸水溶液准确吸取甲酸（5.1.2）0.05mL至50mL容量瓶中，用水稀释至刻度。4℃密封避光保存15天。5.2.20.02%甲酸水溶液准确吸取甲酸（5.1.2）0.20mL至1L容量瓶中，用水稀释至刻度。室温避光保存3天。5.2.310%磺基水杨酸水溶液准确称取2.50g磺基水杨酸（5.1.3），用水溶解后转移至25mL容量瓶中，定容至刻度。室温密封保存1个月。5.3标准品氨基酸标准物质及稳定同位素内标物，纯度大于或等于95%或有证标准物质，37种氨基酸中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量等详见附录A。5.4标准溶液配制5.4.137种氨基酸外标混合标准储备液（2000.00μg/mL）：准确称取0.20g（精确至0.0001g）氨基酸标准品，用水溶解并转移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存3个月。5.4.213种内标混合标准储备液（2000.00μg/mL准确称取0.20g（精确至0.0001g）的标准品，用水溶解并转移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存3个月。5.4.337种氨基酸外标混合标准中间液（10.00μg/mL）：准确移取50.0μL外标混合标准储备液（5.4.1）至10mL的容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存1个月。5.4.413种内标混合标准中间液（10.00μg/mL）：准确移取50.0μL内标混合标准储备液（5.4.2）至10mL的容量瓶中，用一级水定容至刻度。4℃避光保存1个月。5.4.537种氨基酸外标混合标准工作液（2.00μg/mL准确移取1mL外标混合标准中间液（5.4.3）至5mL容量瓶中，用水定容至刻度。临用现配。5.4.613种内标混合标准工作液（2.00μg/mL准确移取1mL内标混合标准中间液（5.4.4）至5mL容量瓶中，用水定容至刻度。临用现配。3T/SATA076—20246仪器和设备6.1液相色谱-串联质谱检测系统：高效液相色谱—串联质谱仪，装配稳定的电喷雾电离源（ESI各项参数指标符合正常工作的要求。6.2分析天平：感量0.001g和感量0.000lg。应校准合格并在检定周期内。6.3微量移液器：经校准合格的微量移液器，量程200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL移液器各一支。6.4涡旋混合器。6.5恒温水浴锅：应校准合格并在检定周期内。6.6离心机：转速不低于10000rpm，应校准合格并在检定周期内。6.7超声机：应校准合格并在检定周期内。7分析步骤7.1样品前处理a)准确吸取50.0μL待测血清后，加入50.0μL内标混合标准工作液（5.4.6涡旋混匀60s；b)加入5.00μL10%磺基水杨酸水溶液（5.2.3），涡旋混匀60s，4℃超声10min；rpm）15min；d)移取200μL上清液，用于LC-MS/MS分析。28天，可根据实际情况进行符合要求的相应调整。使7.2仪器参考条件7.2.1液相条件a)色谱柱：五氟苯基柱（250mm×4.6mm，5μm），或相当者；b)流动相A：0.02%甲酸水溶液（5.2.2）；c)流动相B：乙腈（5.1.1）；d)流速：0.50mL/min；f)进样量：5.00µL；g)洗脱梯度见表1。表1高效液相色谱洗脱梯度参考条件7.2.2质谱条件a)离子源：电喷雾离子源（ESI）；b)检测方式：多反应监测（MRM）；c)扫描方式：正离子模式；d)毛细管电压：5500V；4T/SATA076—2024e)离子源温度：550℃;f)气帘气（Cur）：30psi；g)喷雾气（Gas1）：40psi；h)辅助加热气（Gas2）：40psi；i)碰撞气（Cad）：9psi；j)监测离子对和定量离子对等信息详见附录B。注2：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前7.3标准曲线的制作用0.10%甲酸水溶液（5.2.1）、2.00μg/mL外标混合标准工作液（5.4.5）、2.00μg/mL内标混合标准工作液（5.4.6）配制混合标准溶液工作曲线：0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00、500.00、1000.00ng/mL。标准系列工作溶液中各内标的浓度为200.00ng/mL。将标准系列工作液由低浓度到高浓度依次进样，以待测氨基酸与对应同位素内标的峰面积比值为纵坐标，以标准系列工作液浓度（ng/mL）为横坐标，分别绘制37种氨基酸的标准曲线。不同物质根据实际情况采用不同范围的标准曲线。7.4定性和定量7.4.1保留时间被测试样中目标色谱峰与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在±2.5%之内。7.4.2离子丰度比按照高效液相色谱-串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和标准溶液中各化合物的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的试样与标准工作溶液中相应成分的相对离子丰度,定性时离子丰度比的最大允许偏差见表2。表2定性时离子丰度比的最大允许偏差7.4.3试样溶液的测定将处理完毕的试样（7.1）按仪器参考条件（7.2）进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。8结果计算将液相色谱-质谱测得浓度代入下式计算含量：式中：X——试样中各待测物的含量，单位为纳克每毫升（ng/mLc——从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mLV1——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；V2——取样体积，单位为毫升（mLK——稀释倍数。5T/SATA076—2024结果保留三位有效数字。9灵敏度、精密度9.1灵敏度各氨基酸的定量限及检出限见附录D。9.2精密度依据已发布的行业标准等规范性文件，对方法的精密度进行验证，定量检测下限浓度附近低值CV6T/SATA076—2024（资料性）37种游离氨基酸标准品信息37种游离氨基酸标准品信息见表A.1。表A.137种游离氨基酸标准品信息1CHNO2CHNO3CHNO4CHNO5CHNO6ArgininosuccinicacidCHNNaO7CHNO8AsparticacidCHNO9CHNOCHNOCHNOCHNOCHNOSCHNOSCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOSCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOSCHNOCHNOPCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNO7T/SATA076—2024（资料性）37种游离氨基酸及内标物保留时间、定量定性离子对及碰撞电压、去簇电压37种游离氨基酸及内标物保留时间、定量定性离子对及碰撞电压、去簇电压见表B.1。表B.137种游离氨基酸及内标物保留时间、定量定性离子对及碰撞电压、去簇电压1234567898T/SATA076—20249T/SATA076—2024L-丙氨酸-CL-Ala-CL-精氨酸-NL-Arg-NL-天冬酰胺-NL-Asn-NL-天冬氨酸-NL-Asp-NL-谷氨酰胺-NL-Gln-NL-谷氨酸-NL-Glu-NL-赖氨酸-NL-Lys-NL-丝氨酸-C,NL-Ser-C,NL-色氨酸-C,NL-Trp-C,N注：带为定量离子。T/SATA076—2024（资料性）37种游离氨基酸及13种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图37种游离氨基酸及13种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图见下：T/SATA076—2024图C.137种游离氨基酸及13种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图T/SATA076—2024（资料性）37种游离氨基酸的检出限、定量限37种游离氨基酸的检出限、定量限见表D.1。表D.137种游离氨基酸的检出限、定量限123456789T/SATA076—2024参考文献[1]殷娇阳,田书霞,夏亚飞,等.血液中氨基酸含量测定方法的研究进展[J].中国医院药学杂志,2021,41(03):321-326.DOI:10.13286/j.1001-5213.2021.03.17.[2]王清华,熊筱娟,张凤,等.血液中氨基酸含量的高效液相色谱及其质谱联用测定方法研究进展[J].宜春学院学报,2015,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