T-GRM 101-2024 深色有隔内生真菌胞外代谢物生产技术规范

ICS13.020.01CCSD00/09GRM范ProductionProcessSpecificationsforDarkSeptateEndophytesExtraceIT/GRM101—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 3.1深色有隔内生真菌darkseptateendophytes 3.2胞外代谢物extracellularmetabolite 4产品分类 5要求 5.1人员 5.2生产环境 5.3生产设施与设备 5.4产品外观（感官） 25.5产品技术指标 25.6成分组成要求 26生产技术 26.1菌种要求 26.2母种培养 26.3液体菌剂摇瓶培养 36.4液体菌剂发酵培养 36.5胞外代谢物制备 36.6胞外代谢物粉剂制备 36.7胞外代谢物胶囊制备 37产品参数检测 37.1外观测定 37.2浓度测定 37.3水分测定 37.4pH值测定 47.5粘度测定 47.6生长素测定 47.7保质期 47.8胞外代谢物化合物组分测定 48检验规则 48.1组批规则 48.2取样方法 48.3检验项目 48.4检查与验收 48.5判定规则 4T/GRM101—20249包装、标识、运输和贮存 49.1包装 49.2标识 59.3运输 59.4贮存 5附录A（规范性）胞外代谢物生长素含量测定比色法 6A.1方法提要 6A.2试剂和溶液 6A.3仪器 6A.4标准曲线绘制 6A.5测定步骤 6A.6结果计算 6A.7允许误差 6附录B（规范性）胞外代谢物代谢组测定高效液相色谱质谱法 7B.1方法提要 7B.2试剂和材料 7B.3仪器设备 7B.4样品制备 7B.5高效液相色谱参考条件 7B.6质谱参考条件 7B.7结果分析 8B.8允许误差 8T/GRM101—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。为使我国矿区生态修复菌剂的生产工艺和应用技术走上科学化，规范化轨道，指导矿区微生物复垦工程建设，促进矿区生态环境的恢复与可持续发展，特制定《深色有隔内生真菌胞外代谢物生产技术规范》标准。本标准主要规定了深色有隔内生真菌胞外代谢物的术语和定义、产品分类、要求、生产技术、产品参数检测、检验规则、包装、标识、运输和贮存。本文件由中关村绿色矿山产业联盟提出并归口。本文件起草单位：中国矿业大学（北京）矿山生态修复研究院、西安科技大学西部矿山生态环境修复研究院、天山实验室、北京合生元生态环境工程技术有限公司。本文件主要起草人：毕银丽、彭苏萍、王淑惠、解琳琳、张延旭、王坤、全文智、肖礼、武超、柯增鸣、白雪蕊1T/GRM101—2024深色有隔内生真菌胞外代谢物生产技术规范本文件规定了深色有隔内生真菌胞外代谢物的术语和定义、产品分类、要求、生产技术、产品参数检测、检验规则、包装、标识、运输和贮存。本标准适用于矿区生态修复深色有隔内生真菌胞外代谢物产品。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB20287-2006农用微生物菌剂GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170-2008数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T603-2023化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1深色有隔内生真菌darkseptateendophytes一类定殖于宿主植物根表皮、皮层，甚至维管束组织细胞内和细胞间隙，形成深色有隔菌丝和微菌核特征结构的内生真菌。3.2胞外代谢物extracellularmetabolite活菌在代谢过程中产生并分泌到细胞外的低分子量物质。4产品分类按剂型分为液体、粉剂和胶囊型。5要求5.1人员工作人员应熟练掌握菌种生产所需的专业技术，并注意保持个人卫生。进入生产场地应穿戴经清洗干净且消毒处理的工作服、口罩、鞋、帽等。5.2生产环境环境空气质量应符合GB3095-2012环境空气质量标准。水电安装合理，通风良好，排气通畅，无菌区与有菌区有效隔离。5.3生产设施与设备生产应具备NY/T528-2010食用菌菌种生产技术规程规定的相关设施设备。应具有天平、高压灭菌锅、净化工作台或接种箱、调温设备、除湿设备、恒温、冰箱、显微镜等常规用具。高压灭菌锅应使用经有资质部门生产与检验的安全合格产品。压力容器应符合GB/T150-2024压力容器的规定。配料、2T/GRM101—2024分装、灭菌、冷却、接种、培养等各环节的设施应配套。冷却室、接种室、培养室和贮存室都要有满足其功能的基本配套设施，如控温设施、消毒设施。5.4产品外观（感官）液体菌剂应为澄清溶液，颜色为深褐色或深棕色；固体粉剂产品应松散，灰白色粉末状，具有吸水性；胶囊菌剂由食用级药用明胶和淀粉制成的红黄、蓝白、透明等胶囊壳包装固体粉剂。5.5产品技术指标深色有隔内生真菌胞外代谢物的技术指标应符合表1规定。表1深色有隔内生真菌胞外代谢的技术指标———55——1665.6成分组成要求深色有隔内生真菌胞外代谢物含有有机酸及其衍生物、脂质和类脂质分子、有机杂环化合物、有机氧化合物、有机氮化合物等11种化合物。成分占比应符合表2的规定。表2深色有隔内生真菌胞外代谢物中不同类型化合物组分含量占比6生产技术6.1菌种要求采集矿区本土的深色有隔内生真菌菌种，筛选活性强、植物促生效果好、抗胁迫能力强的菌种。6.2母种培养6.2.1培养基配制PDA培养基：马铃薯浸粉3.0g，葡萄糖20.0g和琼脂粉15.0g混合，加入蒸馏水并定容至1L，加热溶解，分装，pH6.0，121℃高压灭菌15min。6.2.2接种培养在无菌条件下，取直径5mm的菌饼于PDA固体培养基，28℃黑暗倒置培养12-16天，确保菌饼长满整个培养皿。3T/GRM101—20246.3液体菌剂摇瓶培养6.3.1培养基配制MMN培养基：氯化钙0.05g、硫酸镁0.15g、氯化钠0.025g、氯化铁0.01g、磷酸二氢钾0.5g、维生素B10.0001g、磷酸氢二铵0.25g、葡萄糖10g、柠檬酸0.2g和麦芽提取物10g混合，得到混合物，加入蒸馏水并定容至1L，分装，pH5.5，121℃高压灭菌30min。6.3.2接种培养在无菌条件下，取直径5mm的菌饼接种于装有200mLMMN培养基的500mL锥形瓶中，28℃,180rpm振荡培养6-10天，使该菌株生长至对数生长期。6.4液体菌剂发酵培养6.4.1培养基配制蔗糖30g、麦芽提取物25g、磷酸氢二钾2g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.45g和维生素B10.02g，加入蒸馏水并定容至1L，pH7.0，121℃高压灭菌20min。6.4.2接种培养将培养好的母种接种于装有7L发酵培养基的10L发酵罐中，接种量为10%，初始搅拌转速为400rpm，6h-120h搅拌转速设置为300rpm，罐体压力为0.05MPa，共培养4-6天，可采用分批发酵、流加发酵或连续发酵工艺，具体选择视规模和生产需求而定。6.5胞外代谢物制备将DSE菌液分装至10mL无菌离心管，10000rpm，4℃,离心5min，收集胞外代谢物（上清液）。胞外代谢物用无菌注射器通过0.22μm无菌水系醋酸纤维素滤头进行过滤。根据应用需求确定纯化程度。6.6胞外代谢物粉剂制备6.6.1烘干法将提纯后的胞外代谢物放置于烘箱中，60℃烘干至恒重，并通过破碎机破碎为粉末状，便于溶解使6.6.2冻干法将提纯后的胞外代谢物放置于冷冻干燥机中，冷凝器设置温度为-80℃,真空度小于10Pa，脱水24h-48h后使用破碎机破碎为粉末。6.7胞外代谢物胶囊制备将烘干或冻干研磨后的胞外代谢物粉剂使用胶囊机制成胞外代谢物粉剂胶囊，胶囊遇水可以降解，缓释出胞外代谢物，每个胶囊胞外代谢物粉剂含量约0.2g，密封防潮吸水。7产品参数检测7.1外观测定取少量样品放到白色塑料盘中，仔细观察样品的颜色、形状、质地。7.2浓度测定将DSE胞外代谢物冻干，称重测定代谢物质量，计算浓度。7.3水分测定参照GB20287-20066.3.5的规定执行。4T/GRM101—20247.4pH值测定参照GB20287-20066.3.7的规定执行。7.5粘度测定取30mLDSE胞外代谢物倒入粘度计（LC-NDJ-1T）样品槽，采用0号转子测定DSE胞外代谢物的粘度。7.6生长素测定深色有隔内生真菌胞外代谢物生长素含量测定方法参照附录A执行。7.7保质期在产品说明书标明的保质期前，测定产品相应指标。7.8胞外代谢物化合物组分测定深色有隔内生真菌胞外代谢物化合物组测定采用高效液相色谱质谱法参照附录B执行。8检验规则8.1组批规则深色有隔内生真菌胞外代谢物应批次提交验收，每批应保证同等质量的产品组成。8.2取样方法将样品应被分为两份，每个试样不少于完整规格测试所需数量的两倍，分别入带有干燥剂的离心管中，贴上标签，注明试样名称、生产日期。供检验和查用。8.3检验项目本文件5.4、5.5和5.6中规定的所有项目均为出厂检验项目。8.4检查与验收产品需经供方检测，确保其符合本标准要求。需方收到产品后，应根据本标准规定进行检验。如检测结果与标准或合同（订货单）不符，需在收到产品后15日内向供方提出，由双方协商解决。8.5判定规则具下列任何一条款者，均为合格产品：a)检验结果各项技术指标均符合标准要求的产品；b)在产品的外观、水分、pH值、粘度、生长素等检测项目中，有一项不符合要求，而其他各项技术指标符合要求的产品。具下列任何一条款者，均为不合格产品：c)有效活菌数不符合技术指标；d)杂菌率不符合技术指标；e)在外观、水分、pH值、粘度、生长素等检测项目中，有两项（含）以上不符合要求。本文件中产品质量指标合格判定，采用GB/T8170-2008中修约值比较法的规定。9包装、标识、运输和贮存9.1包装根据不同产品剂型选择适当的包装材料、容器、形式和方法，以满足菌剂产品包装的基本要求。产品包装中应有产品使用说明书，在使用说明书中标明使用范围、方法，用量及注意事项等内容。液态菌剂可使用无菌塑料瓶灌装；粉剂产品可使用无菌塑料管包装，或者根据用量独立包装成胶囊，装在瓶内，内置干燥剂防潮。5T/GRM101—20249.2标识产品外包装需明确标注生产日期、保质期、批次、成分含量、贮存条件及适用领域。9.3运输运输过程中有遮盖物，防止雨淋、日晒及高温。保证产品轻装轻卸，避免包装破损。严禁与对微生物菌剂有毒、有害的其他物品混装、混运。9.4贮存液态菌剂应冷藏贮存（2-8℃)。粉剂、胶囊型产品应贮存在阴凉、干燥、通风的库房内，应避免高温、高湿等不良条件的影响。6T/GRM101—2024（规范性）胞外代谢物生长素含量测定比色法A.1方法提要吲哚乙酸（IAA）与Salkowski试剂反应生成粉红色或红色化合物的显色反应。A.2试剂和溶液a)无菌水（或生理盐水）、蒸馏水。b)10.8mol/L硫酸溶液：取683.67mL浓硫酸（98%硫酸）于316.33mL蒸馏水。c)Salkowski试剂：称取4.5g氯化铁于10.8mol/L硫酸溶液，配制1L。d)3-吲哚乙酸标准溶液：10mg黑色素溶解于100mL0.1mol/L氢氧化钠溶液中，得到100μg/mL黑色素标准溶液。A.3仪器紫外分光光度计。A.4标准曲线绘制表A.1不同浓度标准3-吲哚乙酸溶液的制备100234567890A.5测定步骤取4mL样品液与4mLSalkowski试剂混合。在黑暗中孵育20min，然后在540nm处进行比色测定。之后，取4mLSalkowski试剂与4mL标准液在暗处反应30min，用分光光度计测反应液在540nm下的吸光度，设置3组平行，减小实验误差。测得的标准曲线。A.6结果计算根据吸光度，将结果带入标准曲线中，计算生长素含量。A.7允许误差三次平行测定结果的允许不大于0.5%。7T/GRM101—2024（规范性）胞外代谢物代谢组测定高效液相色谱质谱法B.1方法提要将待测样品注入液相色谱-串联质谱仪，采用液相色谱分离，质谱检测器检测，保留时间和质谱的相对离子对丰度定性。B.2试剂和材料a)水：GB/T6682，一级。b)乙腈：色谱纯。c)甲酸：色谱纯。d)0.1%甲酸溶液：取1.0mL甲酸，用水稀释至1000mL，混匀。e)0.1%甲酸乙腈溶液：取1.0mL甲酸，用乙腈稀释至1000mL，混匀。f)微孔滤膜：0.22μm，有机系。g)无菌注射器：1mL。B.3仪器设备a)高效液相色谱质谱联用仪：配有电喷雾离子源（ESI）。b)离心机。c)超声波清洗仪。B.4样品制备用3倍体积的乙腈溶液，4℃,10000rpm，15min下离心。蛋白质沉淀，上