（高清版）DB51∕T 1549-2012 樱桃致死黄化病PCR检验鉴定方法

DB51DB51/T1549—2012樱桃致死黄化病PCR检验鉴定方法2012-12-20发布2013-03-01实施四川省质量技术监督局发布I前言 1范围 1 13试剂和材料 14仪器及用具 25田间取样 26实验室检验 37结果判定与记录 48样品处理 4附录A(资料性附录)樱桃致死黄化病基本信息 5本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则进行编写。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。本标准主要起草人：万佳、宁红、谢成伦、蒋辉、吴志平、郭迪金、陈素清、余坚志、肖连康、朱本标准系首次发布。1樱桃致死黄化病(CherryLethalYellowsphytoplasma,CLYphytoplasma)是由植原体侵染引起黄化组(16SrV),PCR方法是检测该植原体的有效方法之一，可以快速进行樱桃致死黄化病检验鉴定。除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯——灭菌超纯水(ddH₂O)。—研磨液(Grindingbuffer)4.1gKH₂PO₄,21.7gK₂HPO₄,10——Tris液[1M](Tris-HClbuffer)称取12.14gTris试剂，加蒸馏水1L搅拌至溶解，高压灭菌—EDTA液[1M](EDTAsolution)称取37.224gEDTA试剂，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，边搅拌边加入NaOH,调pH值至8.0,加热溶解至澄清，定容1L后高压灭菌保存。——SDS液[10%](SDSsolution)称取20gSDS粉末，加蒸馏水200ml在68℃溶解。DNA提取液(DNAextrationbuffer)取Tris液10ml,EDTA液40ml,SDS液10ml,加热搅拌至70℃混合均匀，调pH=8.0,高压灭菌后室温保存。——蛋白酶K液[10μg/μl](ProteinaseK-Solution)称取5mg蛋白酶K,加入500μl无菌超纯水——十二烷基肌氨酸钠[10%](N-Lauroylsarcosinesodiumsalt)称取1g十二烷基肌氨酸钠，加入——异丙醇(C₃H₈O)。——TE缓冲液(TEbuffer)1MTris-HClBuffer5ml,1MEDTA2ml,将溶液定容到500ml后，——NaCI[5M]称取292.5gNaCl,溶解并定容至1L。—CTAB/NaCl溶液(CTAB/NaClbuffer)4.1gNaCl溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB,加2——苯酚(C₆H₆O)。——氯仿(CHCl₃)。——乙醇(C₂H₅OH)。—PCR混合缓冲液(PCRMixbuffer)含dNTPs、Mg²+、DNA聚合——植原体通用引物(Primers)。利用已报道的植原体16SrDNA和16S-23SrDNA间隔区序列R16mF2:5'-CATGCAAGTCGAACR16mR1:5'-CTTAACCCCAATCATC-3'。——电泳缓冲液TAE(TAEBuffer)。在1L水中加入Tris碱242g,冰醋酸57.1ml和37.2gNa₂EDTA·2H₂O,pH8.5,配置成50倍贮存液；使用时稀释为1倍工作液。——琼脂糖凝胶[2%](Agarosegel)。在TAE溶液中加入2%琼脂糖，融化后在每100ml琼脂糖中加入5μlDNA荧光染料(GV),冷却至60℃到入相应制胶槽中，插入梳子，冷却凝固备4仪器及用具——电子天平(1/100g,1/10000g)。——研钵(内径60mm～80mm)。——移液器(2μl~10μl、10μl~50μl、10μl~200μl、200μl~1000μl和1μl~5μl)。——聚合酶链式反应仪(PCR仪)。(平方米)5个样品10个样品20个样品25个样品注：不同品种面积及采样数量分别计算，每20张叶片为1个3——称取1g剪碎并混合均匀的叶片，加适量液氮充分研磨后，加入1ml研磨液rpm离心15分钟。—弃上清，加入500μl的DNA提取液，20μl蛋白酶K,80μl10温浴1-2小时后，在4℃下6000rpm离心10分钟。——取上清，加入400μl的异丙醇颠倒混匀，-20℃保持30分钟后，在4℃下12000rpm离心15浴30分钟~60分钟。——加入100μl5MNaCl混匀后，加入84μlCTAB/NaCl,在65℃下温浴10分钟。——加入等体积的氯仿/异戊醇，12000rpm离心5分钟，取上清；再加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，12000rpm离心5分钟。——取上清，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA,4℃下13000rpm离心15分钟。——弃上清，加入500μl70%乙醇洗涤，4℃下13000rpm离心10分钟。——弃上清，真空干燥DNA,加适量的TE悬浮，4℃下保存备用。PCR扩增需设阴性对照(模板为双蒸水)和阳性对照(模板为已知感染樱桃致死黄化病植株的PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸60秒，共35个循环；72℃延伸8分钟。将PCR产物8μl与样品缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶的点样孔中，同时设DNAladder作为片段大小的标准。100伏电压电泳30分钟。4将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察窗内，观察分析并成像保存。有该特异性条带；供试样品出现与阳性对照相同大小的1432bp特异性条带，样品为阳性，判定为带樱桃致死黄化病植原体；供试样品未出现与阳性对照相同大小的1432bp特异性条带，样品为阴性，判定5(资料性附录)樱桃致死黄化病基本信息A.1分类地位樱桃致死黄化病植原体隶属于细菌界(Bacteria),硬壁菌门(Firmicutes),柔膜菌纲(Mollicutes)(又称软球菌纲),非固醇菌原体目(Acholeplasmatales),非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae),植原体候选属，16SrV组(榆树黄化组)。A.2病原特征该植原体无细胞壁，约8nm~100nm,能够通过细菌滤器，多型性，有球形、椭圆形、长杆形、梭形、带状和多态不规则形等。A.3典型症状该病危害严重，寄主感病后几年时间内死亡率可高达100%。侵染后1~2年，主要表现在晚春叶片黄化，秋天落叶提早、开花推迟，新梢叶片卷曲、皱缩、叶肉变厚，果实小