细菌性突发公共卫生事件的实验室检验技术课件

上海市临床检验中心细菌性突发公共卫生事件的实验室检验技术上海市临床检验中心细菌性突发公共卫生事件分类细菌性呼吸道疾病:群体性发热细菌性食源性疾病:食物中毒细菌性生物恐怖事件:炭疽白粉事件上海市临床检验中心细菌性呼吸道疾病流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)链球菌病(猩红热、人感染猪链2病)肺鼠疫土拉热（弗朗西斯菌）肺炭疽军团菌病上海市临床检验中心检验样本的选取原则根据病情的发展,本菌可相继存在于鼻咽腔、肺泡灌洗液、血液、淤血点及脑脊液等标本中，在实验室检测中应取相应检材上海市临床检验中心标本的检验意义

脑脊液、血液、皮肤粘膜出血点挤出液、肺泡灌洗液中检出病原菌可直接作为确诊依据

咽拭子一般是对健康人群或病人密切接触者进行带菌检验时采集，对病人如采集此标本，在诊断上仅有参考价值上海市临床检验中心CSF标本的采集脑脊液(CSF)：是用于分离和鉴定病原体最好的标本取CSF2～3ml，注入无菌试管内，3000转/分，离心20分钟，用无菌吸管取沉淀物直接接种CSF沉渣还可涂片，作G染色镜检CSF离心后的上清液供做血清学检查特异性抗原和（或）DNA特异片段，以对病人进行早期快速诊断

上海市临床检验中心血标本的采集在疾病早期，病人高热时采取静脉血，及时分离纯培养物供鉴定留2ml血注入无菌试管内分离血清，胶乳凝集试验检查特异抗原、PCR测DNA特异片段和ELISA测急性期抗体在病人病后1～2周采取第二次血液2ml，分离血清检查病人恢复期抗体以作追溯性诊断上海市临床检验中心出血点渗出液标本的采集选择新出现的皮疹，以75%酒精消毒局部皮肤，用无菌针头挑破淤点或淤斑，轻轻地挤出组织液用无菌毛吸管吸取渗出液先增菌后分离、培养将渗出液涂片，作G染色镜检上海市临床检验中心咽拭子标本的采集采样时，令受检者尽量张开口，用压舌板将其舌头轻轻压下，用前端略向上弯曲45度角的无菌棉拭子探入口腔内悬雍垂后面的鼻咽孔部位，小心涂抹该部粘膜数次，然后小心退出，注意尽量不接触口腔其余部位咽拭子直接接种到选择性平皿分离病原菌上海市临床检验中心样品的处理和运送

及时处理样品：采集样品后应尽可能地做到床边接种，若无可能则应在最短地时间内送至实验室进行接种培养早期采集样品：应尽可能采集病人用药前的早期样品，可以明显提高病原菌的检出水平保温运送：Nm对温度较为敏感，应保持样品处于20

C～36

C之间，切不能低温运送（检测抗体的血清标本除外）

上海市临床检验中心细菌性生物恐怖事件炭疽白粉事件：直接吸入导致肺炭疽病原体：毒力型炭疽杆菌，即含有毒素质粒（pxo1）和荚膜质粒（pxo2）的菌株（tox+cap+）并不是要从分类学的角度去决定一种细菌是不是炭疽芽孢杆菌，或蜡样芽孢杆菌的炭疽亚种，而是这种细菌能不能引起炭疽疾病。而炭疽疾病的决定因素是那两个质粒上的致病基因，缺一不可上海市临床检验中心细菌性食源性疾病由细菌通过摄食而进入人体的，使人体患感染性或中毒性的一类疾病。属食源性疾病范畴，主要包括细菌性肠道传染病和细菌性食物中毒上海市临床检验中心细菌性肠道传染病属我国法定传染病，主要包括霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒及新近参照传染病管理的由肠出血性大肠埃希菌O157引起的出血性肠炎上海市临床检验中心细菌性食物中毒人体摄入了被细菌或其毒素污染的食品后所出现的非传染性急性、亚急性疾病上海市临床检验中心各类样品采集方法（1）粪便、肛拭：粪便标本应尽量在病程早期和治疗前采集，同时应采集新鲜粪便，选取有脓血、粘液部分3-5克、水样便取含絮状物的2-5ml，盛于无菌容器中及时送检。若无法获得粪便时，可用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门4-5cm深处（小儿2-3cm），轻轻转动一圈，擦取直肠表面的黏液后取出，盛入运送培养基或保存液中送检。注意为保证多个检验项目的开展，同一病人应至少采集2支肛拭

上海市临床检验中心各类样品采集方法（2）呕吐物：直接放入无菌容器中及时送检

咽拭样品：采集时应将棉签檫拭咽喉及扁桃体红肿处（特别是白膜处），然后将棉签插入4-5ml生理盐水中，尾部弃去

血液：采集患者急性发病期（3天内）和恢复期（2周左右）各3ml全血分离血清送检

上海市临床检验中心检验项目霍乱弧菌、副溶血弧菌及其它致病性弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、沙门菌、变形杆菌、致泻性大肠埃希菌、空肠弯曲菌、小肠结肠耶尔森菌、志贺菌、溶血性链球菌及单核细胞增生李斯特菌引起的食源性突发事件的样品检验

上海市临床检验中心细菌性食源性疾病的检验宗旨竭尽全力尽快找到病原体快速、准确可与传统方法不一定完全相同

上海市临床检验中心检验程序

1.样品采集

↓2.初步检验→活菌数、直接镜检(涂片→染色→镜检)↓3.分离培养

(包括增菌培养和直接平板培养)↓4.初筛试验↓5.纯培养↓6.全面鉴定上海市临床检验中心直接涂片染色镜检

观察存在于检品中特种形态的细菌如霍乱弧菌、弯曲菌，为进一步的检验提供有用的信息

上海市临床检验中心检样的处理

病源检样因含较多病原菌而一般无须做预增菌处理，但若病源检样为服过抗生素后采集的检样应按检验项目要求而进行预增菌处理以保护和放大目的病原菌直接插入2mlTSB管37℃预增菌4～6h上海市临床检验中心直接培养

将无须做增菌处理的病源检样按检验项目要求直接接种于各相应培养基

上海市临床检验中心增菌培养及接种

将预增菌处理后的服过抗生素后采集的病源检样按检验项目要求接种各相应增菌液培养

增菌培养后接种于各相应培养基

上海市临床检验中心初筛试验克氏双糖/三糖铁/肠道综合发酵管1、管2PCRVIDAS

上海市临床检验中心可疑菌的鉴定

全面生化试验（API、ATB、VETIK、IDS、SWF、手工鉴定等）

噬菌体试验

血清分型

毒素或毒素基因测试

上海市临床检验中心毒素或毒素基因测试

霍乱弧菌肠毒素、葡萄球菌肠毒素、EIEC侵袭毒素、ETEC肠毒素按国标方法进行动物试验或酶联免疫试验（VIDAS等）毒素基因测试：霍乱弧菌肠毒素、葡萄球菌肠毒素、致泻性大肠埃希菌的所有毒力基因均可用PCR检测，特别是对致泻性大肠埃希菌的定论应以毒素或毒素基因为准

上海市临床检验中心患者血清的试验

疑似伤寒或副伤寒的患者应取发病一周的血清做肥达氏反应，用作辅助诊断将患者急性期和恢复期的血清做凝集效价的对比，4倍增长可确诊上海市临床检验中心检验结果的判定

应以找到病原体或其毒素为最终结论，在此之前所有的快速检验方法如PCR、VIDAS等得到的结果仅供参考

应注意非病源检样与病源检样检出的病原体的统一性

上海市临床检验中心检验结果的判定原则（1）多数患者样品中检出的致病意义明确的细菌在种类、生化和/或血清型、毒素型均一致时，可报告为细菌性食源性疾病事件的病原体上海市临床检验中心检验结果的判定原则（2）非病源检样与病源检样检出占绝对优势但通常致病意义不甚明确的细菌如大肠艾希菌、溶藻弧菌等，且其在种类、生化和/或血清型均一致，同时本次细菌性食源性疾病事件中非患者对照标本中未检出该菌时，应做该菌的毒素、毒素基因或动物试验，阳性结果可报告为细菌性食源性疾病事件的病原体上海市临床检验中心检验结果的判定原则（3）

样品中检出的生化、血清符合致泻性大肠艾希菌、金黄色葡萄球菌，一定要以毒素、毒素基因测试阳性为最终结论报告蜡样芽胞杆菌在非病源检样中须达到105cfu/g(ml)以上者才有报告价值

上海市临床检验中心细菌检验重要筛检试验接触酶试验氧化酶试验上海市临床检验中心

氧化酶试验用于分辨G-杆菌中肠杆菌科及弧菌科两类细菌

革兰阴性杆菌阳性反应

弧菌科阴性反应肠杆菌科上海市临床检验中心接触酶试验用于分辨葡萄球菌及链球菌阳性反应葡萄球菌

革兰阳性球菌阴性反应链球菌接触酶接触酶-+上海市临床检验中心

沙门菌检测上海市临床检验中心概况1880年发现，至今已有2600种有动力（除鸡-雏沙门菌）大多产H2S

（除副甲伤寒沙门菌等）产酸大多产气（除伤寒、鸡-雏沙门菌）靛基质-、蔗糖-、乳糖-甘露醇+符合肠杆菌科特征（葡萄糖+、硝酸盐还原+、氧化酶-）上海市临床检验中心沙门菌的初筛肠道综合发酵管1：甘露醇（上斜面）+葡萄糖（下直面）+产气肠道综合发酵管2：蔗糖-、动力+、H2S+、靛基质-上海市临床检验中心血清凝集（1）A-F多价+OH1H2上海市临床检验中心血清凝集（2）若生化反应符合，而血清A-F多价-，考虑：Vi抗原（伤寒、副丙伤寒沙门菌）遮蔽，煮沸后再凝亚利桑那菌：迟缓发酵乳糖，延长Mac平板培养时间至4天可能是A-F以外的沙门菌：如O39：Hb，2旺次渥沙门菌在上海地区多见极可能是血清交叉的柠檬酸杆菌上海市临床检验中心报告方式A群

甲型副伤寒沙门菌1,2,12:aB群

乙型副伤寒沙门菌1,4,5,12:b:1,2

鼠伤寒沙门氏菌1,4,5,12:i:1,2

C群

丙型副伤寒沙门菌6,7,vi:c:1,5

猪霍乱沙门菌6,7,:c:1,5D群

肠炎沙门菌1,9,12:g,m

伤寒沙门菌1,9,vi:d

鸡雏沙门菌1,9,12:-上海市临床检验中心

志贺菌检测上海市临床检验中心概况至今已有4群（A、B、C、D）、32种（A-痢疾志贺菌10个血清型；B–福氏志贺菌6个血清型+X、Y变种；C-鲍氏志贺菌15个血清型、D-宋内1个血清型，S，R两相）无动力乳糖-

（除宋内迟缓发酵+）不产H2S产酸不产气（除F6产极少量气泡）靛基质大多+（宋内-）、蔗糖-甘露醇+（痢疾志贺菌为-）符合肠杆菌科特征（葡萄糖+、硝酸盐还原+、氧化酶-）上海市临床检验中心志贺菌的初筛肠道综合发酵管1：甘露醇（上斜面）+/-葡萄糖（下直面）+不产气肠道综合发酵管2：蔗糖-、动力-、H2S-、靛基质+上海市临床检验中心血清凝集（1）ABCD4组O抗原多价凝集血清群O单价型特异抗原种特异抗原（3，4，6，7）上海市临床检验中心血清凝集（2）若生化反应符合，而血清A-F多价-，考虑：A、C群志贺菌O抗原外有K包膜抗原遮蔽，煮沸后再凝可能是EIEC，再做大生化以鉴别（产气、ONPG）宋内的R相菌，用R相血清凝集可能是蜂窝哈夫尼亚菌，做大生化以鉴别可能是类志贺邻单胞菌，观察动力、氧化酶上海市临床检验中心报告方式痢疾志贺菌1型福氏志贺菌2a型福氏志贺菌X变种鲍氏志贺菌13型宋内志贺菌S相上海市临床检验中心大肠杆菌O157：H7检测上海市临床检验中心概况1885年德国人艾希自人畜肠腔分离出（E.coli），人类认识该菌为正常细菌1945年Bary自病儿腹泻便中大量检出E.coli，并证实该E.coli是病源逐渐认识E.coli有两类：正常E.coli和致泻E.coliEIEC、EPEC、ETEC1982年美国发现有种E.coli引起出血性肠炎（HC）和溶血性尿毒综合征（HUS）1987年levine提出EHEC概念，指出SLT毒素是病因1996年日本9000名儿童暴发，11人死亡，E.coliO157：H71999年我国暴发？上海市临床检验中心大肠杆菌0157:H7检测大肠杆菌O、H抗原不同分成200多血清型山梨醇不发酵（95%E.coli发酵）葡萄糖醛酸酶阴性（96%E.coli阳性）判断为肠出血性大肠杆菌（EHEC），除血清型符合0157:H7或H-外，还须证实SLT（VT）阳性上海市临床检验中心李斯特菌检测上海市临床检验中心该菌1926年被确认为是人兽共患病菌，但很快受到重视：分布广泛，在全世界的土壤、水中都有存在，温带比热带更多见易感动物多，除人类外，迄今已从42种哺乳动物，22种禽类、鱼类、甲壳动物中分离出来，其中易感性最高的是牛、兔、犬、猫低温下可生长，虽然此菌属于中温型，但其生长温度宽，为1—45℃在4－6℃的低温下也可繁殖。因此，放在冰箱中的食品，或经冷藏运输的食品，如有此菌存在，它们都可生长繁殖并使人致病1988年世界卫生组织证实为食物中毒病原菌：此菌可以通过水源、食品原料、厨房食物制作中任何一个环节的污染传播给人类。主要的食品有4种：①牛乳和乳制品：②肉类，特别是牛肉及其制品；③蔬菜、沙拉等食品；④海产品概况上海市临床检验中心本菌为革兰氏阳性杆菌，菌体短小，直或稍弯在22℃～25℃环境可形成4根鞭毛，故在25℃幼肉汤培养物中运动活泼，37℃基本无动力。幼龄培养物为革兰氏阳性，衰老培养物可转为革兰阴性，呈两极着色，易误认为双球菌。

形态、动力与染色上海市临床检验中心本菌营养要求不高，在20-25℃培养有动力，穿刺培养，2-5天可见倒立伞状生长该菌的生长范围为2--42℃（故可用4℃冷增菌以抑制其它杂菌的干扰），最适培养温度为35--37℃初期在5%羊血琼脂平板上菌落细小、露滴状、光滑、透明，后变灰暗。单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌在血平板上的菌落有狭窄的β-溶血环

培养特性上海市临床检验中心弯曲菌检测上海市临床检验中心本菌为革兰阴性菌，呈S形、螺旋状或纺锤生长要求为微量的有氧条件培养最适宜温度为42℃在选择性平皿上，可形成两类菌落1.第一型菌落不溶血、灰白色、扁平、湿润、有光泽、有扩散趋势，看上去象水滴，有从接种划线向外扩散的倾向2.第二型菌落不溶血、菌落是分散单个的(直径1～2mm)凸起，完整发亮的菌落形态、培养特性上海市临床检验中心快速检测技术在细菌实验室检验中的应用上海市临床检验中心微生物诊断的演化(A)

1673年：显微镜发明1880年：人工培养基发明1914年：干燥培养基发明1970年以前：忙于分离各种细菌，采用生化及血清学鉴定上海市临床检验中心微生物诊断的演化(B)

1970年以后：电脑化+细菌数值分类鉴定的应用1980年：微量快速生化的应用及全自动鉴定系统的产生1985年以后：各种免疫及核酸技术的广泛应用上海市临床检验中心培养基的进步利用细菌的专有酶进行快速筛选原有筛选培养基的不足：SS、Mac、WS、XLD沙门氏菌具有辛酸酯酶，以β-萘酚辛酯为底物，经沙门氏菌酶解，释出β-萘酚与固兰作用出现紫红色大肠埃希氏菌具β-葡萄糖醛酸酶，但以O157：H7为代表的肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）却不具此酶，故β-葡萄糖醛酸酶阴性已成为初步筛查EHEC的重要特征上海市临床检验中心E.coliO157:H7ID显色培养基典型菌落O157：H7墨绿色菌落上海市临床检验中心沙门菌粉色菌落沙门菌ID显色培养基典型菌落上海市临床检验中心细菌微量快速鉴定系统（手工）

API

MicroScanRap-IDEnterotube

细菌鉴定的微量多项试验套组可使微生物有一标准的鉴定材料，不会因为所使用的培养基不同而鉴定出不同菌名。可缩短鉴定的时间。传统试管鉴定法需配制各种不同培养基，非常麻烦，而鉴定套组一次可配上好几百个，可存放。套组鉴定可以给细菌一个号码，代表生物型号码，以此作为追踪传染源的依据。上海市临床检验中心细菌微量快速鉴定系统（自动）

AMS

，

ATB，BIOLOGVITEK上海市临床检验中心獨特的試卡設計定向試驗標記樣本碼卡片碼載有底物的小孔批號卡片名稱VITEK上海市临床检验中心直接从标本中检查微生物抗原

应用单克隆抗体结合各种形式的放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、荧光免疫分析（FIA）、时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）、化学发光免疫分析（CIA）、生物发光免疫分析（BIA）等，足以检出临床标本中痕量的微生物抗原，免去细菌或病毒培养过程，直接完成微生物感染的快速诊断

上海市临床检验中心VIDAS筛检致病菌ELFA检测技术全自动疫浓缩增菌技术上海市临床检验中心上海市临床检验中心样本肉汤於SPR内流动Vidas免疫分析5个自动步骤不断的清洗标致著的抗体跟目标微生物抗原结合免疫夹心形成仪器阅读最终萤光值AntibodiescoatedontheSPRwall,specificallycapturethemicroorganismbeingdetectedOrganismbeingdetectedOtherorganismsSampledispensedintothestripAbconjugatedtoalkalinephosphatase4methylumbelliferylphosphateResidueafterwashingAgtobedetectedBoundAb上海市临床检验中心VIDAS提供8种试条

用於不同致病菌的检测VIDASLMO VIDASLIS VIDASSLMVIDASICS单增李斯特 李斯特氏菌 沙门氏菌 免疫浓缩沙门氏VIDASSET VIDASCAM VIDASE.COVIDASICE金葡肠毒素 弯曲菌 大肠杆菌O157免疫浓缩O157上海市临床检验中心免疫浓缩例子用禽肉样本的蛋白胨水涂布He平板免疫浓缩前40分钟免疫浓缩後

上海市临床检验中心成品培养基手工/自动鉴定系统全自动检测系统生物梅里埃提供符合需要的完整解决方案上海市临床检验中心快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物

糖苷酶

色原（荧光）糖苷结合物糖苷+色原（荧光）氨基肽酶色原（荧光）氨基酸结合物氨基酸+色原（荧光）

上海市临床检验中心快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物常用呈色的色原有：α、β萘酚，邻位或对位硝基酚，对硝基苯胺，酚酞，2-氨4-硝基苯常用的荧光物有：4-甲基伞形酮（4MU），7氨基4甲基伞形酮香豆素

上海市临床检验中心细菌的致病作用细菌的致病作用是否发生与3要素：毒力、侵入数量、侵入部位有关毒力：毒素、侵袭力毒素：来源、理化性质、作用分成内毒素（G-产生）、外毒素（G+产生）2类侵袭力：突破机体屏障、在体内定居、繁殖、扩散的能力，菌毛、侵袭性酶上海市临床检验中心快速检出细菌的毒素

直接检出细菌的毒素，常比细菌培养更可靠。难辨梭菌产毒素埃希氏菌（ETEC）LT（热敏毒素）与ST（耐热毒素）肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）VT/SLT金黄色葡萄球菌多种肠毒素霍乱弧菌肠毒素副溶血弧菌TDH上海市临床检验中心引物名称产物长度Bp基因位点名称ETEC-Lt450大肠杆菌热敏感型肠毒素（heat-labileenterotoxin）ETEC-St190大肠杆菌热耐受型肠毒素（heat-stableenterotoxin）EPEC-BfpA324geneformajorstructuralsubunitofbundle-formingpilusEPEC-EaeA384大肠杆菌intimin基因EHEC-Stx1150大肠杆菌志贺样毒素I型EHEC-Stx2255大肠杆菌志贺样毒素II型EC-CadC282大肠杆菌赖氨酸脱羧酶调节子（lysinedecarboxylaseregulator）EHEC-HlyA498EHEC溶血素基因（EHEC-hemolysin）Salm-InvA582沙门氏菌侵袭蛋白（invasionprotein）Shig-IpaH679志贺氏菌侵袭蛋白质粒抗原H（invasionplasmidantigenH）引物名称产物长度Bp基因位点名称tcpA235霍乱弧菌毒素协同菌毛基因（toxincoregulatedpilusA）VPToxR368副溶血性弧菌直接溶血素基因（TDH）ctxA564霍乱弧菌肠毒素A基因（choleratoxinA）VChlyA481霍乱弧菌溶血溶细胞蛋白基因(hemolytic-cytolyticA)YST208耶尔森肠炎杆菌耐热肠毒素基因（YersiniaHeat-StableEnterotoxinGene）CadF418空肠弯曲菌粘连素基因（CampylobacteradhesiontoFibronectin）Cpa324产气荚膜梭菌磷酸酶C基因（ClostridiumperfringensphospholipaseC）BCnprC688蜡样芽胞杆菌中性蛋白酶基因（neutralproteasegene）上海市临床检验中心DNA RNA

蛋白质抗体反应代谢反应脂肪酸特征

为什么要以基因技术为检测基础?

上海市临床检验中心

上海市临床检验中心PCR技术的具体应用健康从业人员体检致病微生物阳性检出率的提高食物中毒应急