《有机化学》课件-21-2

21.2多肽—、多肽的结构和命名

一分子α-氨基酸的氨基和另一分子α-氨基酸的羧基之间缩水所生成的酰胺化合物称为肽(peptide,此名词来自于希腊语“消化”，因为肽首先是由部分消化的蛋白质得到的）。肽分子中的酰胺键称为肽键(peptidelinkages)。

由两个或三个氨基酸形成的肽叫做二肽或三肽。由多个氨基酸形成的肽称为多肽。在肽分子中每个氨基酸结构部分称为氨基酸单位(残基）。

在蛋白质分子中，氨基酸也是通过肽键连接起来的。实际上,蛋白质就是相对分子质量很大（约一万以上）的多肽。所以了解多肽的结构和性质是研究蛋白质的重要基础。

开链状的肽总有两个末端。含游离氨基的一端称为N端，通常写在左边;含游离羧基的一端称为C端，写在右边。肽的命名是从N端开始，由左至右依次将每个氨基酸单位写成“某氨酰”，最后一个氨基酸单位的羧基是完整的，写为“某氨酸”。例如:

在肽的命名中，还经常用缩写符号来表示氨基酸单位,符号之间用短线隔开。上面的三肽为:Ala-Gly-Phe。

二、多肽结构的测定

多肽(或蛋白质）的结构与其生物功能密切相关。可以打个简单的比喻，多肽与氨基酸的关系相当于英文单词与字母的关系。各种字母(26个)的特定排列可以得到特定含义的词，各种氨基酸(约二十多种)在肽链中的排列顺序可以决定一个肽(或蛋白质）的生物功能。例如，如果将food(食物）中的字母d用1代替，该词的含义随之变化(fool,傻子）。类似地，如在催产素(一种9肽）中，它的亮氨酸被异亮氨酸代替所形成的肽，则严重丧失刺激乳汁分泌和催产能力。

确定多肽结构是一项非常复杂而细致的工作。英国化学家桑格（F.Sanger)花了十年的时间在1955年首次测定出牛胰岛素的氨基酸顺序。[F.Sanger,1918年出生于英国，在Cambridge大学获博士学位，他的牛胰岛素测定工作获1958年Nobel化学奖Q他又因在含

5375个核苷对的DNA测定工作与P.Berg和W.Gilbert分享1980年Nobel奖。]桑格的工作为多肽结构测定奠定了基础。近四十多年来，随着分离、分析技术的发展，有许多蛋白质或多肽的结构相继被确定。如：降压素（9肽）、牛催产素（9肽）、增压素（10肽）、核糖核酸酶（124肽）、糜蛋白酶(241肽）、甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(333肽)等。

以下仅简单介绍测定多肽结构的一般步骤和方法。确定多肽的结构，应从两方面着手。

首先测定组成多肽的氨基酸种类和数目；然后测定这些氨基酸在肽链中排列的顺序。1.完全水解

完全水解的目的是为了测定组成多肽的氨基酸种类。将多肽在6mol/L的盐酸中，100°C〜120°C温度下加热10〜24小时，多肽可完全水解成氨基酸。用电泳、层析法或氨基酸自动分析仪将水解混合物进行分离、鉴定，并测定其相对含量。然后根据相对分子质量（用物理化学方法测定)计算出各氨基酸可能的分子数目。

色氨酸在酸性水解时，会发生分解（吡咯环被破坏），但在碱性溶液（2mol/LNaOH，100°C)中水解，能够测定色氨酸。测定多肽结构一般都用酸性水解，这是因为碱性水解会使精氨酸、光氨酸、丝氨酸、苏氨酸都遭受破坏，而且其他氨基酸易发生外消旋。

氨基酸在肽链中的排列顺序是多肽结构测定的核心，也是比较棘手的问题，一般可用端基

分析和部分水解相结合的方法来完成。2.端基分析

所谓端基分析(terminalanalysis)就是通过一定的化学方法确定肽链的N端或C端氨基酸的种类。(1)N端分析

测定N端的方法较多，主要介绍以下两种：A.桑格法（Sangermethod)2，4-二硝基氟苯（DNFB)与肽链N端的游离氨基发生反应，生成二硝基苯基（DNP)衍生物9。9在酸中水解时，肽链断裂，但DNP键保留，N端氨基酸转化为N-二硝基苯基取代的衍生物。后者很容易分离，可用光谱法鉴定。DNFB不仅可以和α-NH2作用，它也可与氨基酸分子中其他氨基反应，生成相应DNP衍生物。DNFB是英国化学家桑格1945年发现的，因此称为桑格试剂。他首先用于测定牛胰岛素的结构，随后，桑格试剂即成为测定肽链N端的重要试剂。桑格法的缺点是在水解时，整个肽链都被破坏，所以在肽链上只能进行一次N端分析。B.爱德曼（Edman)降解法

异硫氰酸苯酯与N端氨基反应生成苯基硫脲衍生物。在有机溶剂中用无水氯化氢处理，N端氨基酸以咪唑衍生物形式从肽链上断裂下来。可用萃取法分离，用气一液分配色谱法，以标准氨基酸衍生物做参照，进行鉴定。

由上式可以看出，在用HC1(无水）处理苯基硫脲衍生物时，肽链的其余部分不受影响而被保留下来，这样又获得了一个新的N端氨基。用同样的方法可确定下一个氨基酸组分，如此循环重复，能连续测定从N端到C端的氨基酸顺序。这种方法是瑞士化学家爱德曼于1950年提出来的，因此称为爱德曼降解法。一般情况下，它能有效地鉴定约40个端基氨基酸。现在已可用仪器自动进行鉴定。利用这种方法曾在肌红蛋白（153肽）的结构测定中成功地分析了N端的前60个氨基酸。

此外还有丹酰氯[5-(二甲氨基)萘-1-磺酰氯]和N端游离氨基反应，经水解后所生成的产物能发生荧光，可用纸层析或薄层层析法分离鉴定。（2）C端分析A.羧肽酶法

羧肽酶(carboxypeplidase)是催化C端氨基酸水解的特效酶。也就是说，在羧肽酶作用下，只有靠近游离羧基的那个肽键发生水解，而其他肽键不变。由此可以确定C端氨基酸的种类。

水解所生成的余肽(肽的剩余部分），在羧肽酶作用下可继续水解。与爱德曼法相似，重复进行，可依次确定C端的下一个氨基酸，但这种方法只能重复有限的几次。

羧肽酶水解是C端分析的主要方法。B.酰肼法

在一般条件下，羧酸与肼不作用，而酰胺与肼反应可生成酰肼。当多肽与肼一起加热时，除C端氨基酸外，所有的氨基酸都以它们的酰肼衍生物释放出来。C端氨基酸可用纸色谱法进行鉴定。

用端基分析法一般只能确定相对分子质量较小的多肽的结构。对于相对分子质量较大的多肽(或蛋白质)还要使用部分水解法，先将多肽水解成若干较小的肽碎片，分别用端基分析法确定这些肽碎片的氨基酸顺序。然后再根据它们彼此重叠部分而“拼搭”出整个肽链的结构。3.部分水解

蛋白酶对肽键的水解有催化作用，但每一种蛋白酶只能水解一定类型的肽键，选择性很强。例如:糜蛋白酶(chymotrypsin)只能断开苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸羧基上的肽键;胰蛋白酶(trypsin)只能断开精氨酸及赖氨酸羧基上的肽键；胃蛋白酶（pepsin)只能断开苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸氨基上的肽键。我们正是利用这些特殊蛋白酶的选择性催化作用，使多肽进行部分水解，断裂成若干肽碎片，为多肽结构测定提供一定的信息和方便。

假定有一个多肽，经酸性水解，分离、鉴定水解产物，它含有8种氨基酸:丙、亮、赖、苯丙、脯、丝、酪、缬，其含量比都是1:1。经相对分子质量测定证明它是由上述8种氨基酸组成的八肽。从端基分析知道N端为丙，C端为亮。该肽用糜蛋白酶水解时生成酪氨酸、一个三肽和一个四肽。三肽经端基分析得知N端为丙，C端为苯丙。四肽的N端为赖，C端为亮。三肽在胃蛋白酶作用下水解为苯丙和一个二肽（丙—脯）。四肽在胰蛋白酶作用下水解为赖氨酸和一个三肽，该三肽的N端是丝。根据以上测定结果我们可以“拼搭”出该八肽的结构为：

丙—脯—苯丙—酪—赖—丝—缬—亮三、多肽的合成

确定了多肽(或蛋白质）的结构，对化学家来说所面临的另一个挑战是多肽的合成。多肽的合成主要是基于氨基酸之间脱水形成酰胺键(肽键）的反应。该反应本身并不复杂，但多肽的合成工作却相当困难。即使合成一个最简单的二肽（如甘一丙），也不是那么容易。当甘氨酸和丙氨酸一起反应时，除生成所期望的甘一丙二肽外，还会有丙一甘、甘一甘、丙一丙三种二肽副产物。因为氨基酸是双官能团化合物，甘氨酸、丙氨酸的羧基和氨基可以两两交叉反应。

欲从这多种二肽混合物中将少量的甘—丙二肽分离出来是极其困难的。况且生成的二肽分子中仍有游离的羧基和氨基，它们之间还能进一步缩合，生成其他化合物。

由此可以看出，要使氨基酸在指定的羧基和氨基之间形成肽键，以合成所需要的肽，必须把其他氨基和羧基保护（封锁)起来，使它们不参加生成肽键的反应。所用的保护试剂必须满足以下两个条件:（1)它易于接到被保护的基团上去；（2)完成保护任务后，保护基团易于脱掉而不影响肽键。

氨基和羧基的保护是多肽合成的关键。寻找合适的保护剂曾经是化学家的主要难题。现在难题已经得到解答，化学家们陆续找到了一些较好的保护剂，使多肽合成工作得到了很大的发展。1.氨基的保护

保护氨基主要用以下两种试剂:

(1)氯甲酰苄酯(2)叔丁氧羰基叠氮

叔丁氧酰基可简写为BOC。该保护基对催化氢化是稳定的。在多肽合成中，根据具体情况可分别选用Cbz或Boc两种保护方法。2.羧基的保护

羧基可与甲醇、乙醇或苄醇生成醋而得到保护。因为酯的水解比酰胺容易，所以当肽键形成后，可用稀碱在室温下水解去掉保护基。

如果用苄醇保护，则所生成的苄酯还可用氢解的方法将保护基去掉:3.肽键的形成

分别将不同的氨基酸中的氨基和羧基进行保护后，就可以按指定顺序合成多肽。为了更有效地形成肽键，还需要对参与形成肽键的羧基进行活化。常用的活化剂是二环己基碳化二亚（dicyclohexylcarbodiimide)，即DCC。DCC与羧基能形成一种活泼的异脲衍生物，后者可立即与第二个已经保护好羧基的氨基酸反应而生成肽键。目前这是应用最广泛的一种活化羧基的方法。下边以合成二肽为例，说明合成的一般步骤。

在这里，当肽键形成后，可以用氢解法同时将N保护剂和C保护剂去掉。反应中生成的二环己基脲脱水后又可转化为DCC，继续使用。

如果需要进一步加长肽链，则只把其中一个保护基去掉，形成一种新的含有游离羧基或氨基的化合物。然后按上述方法把特定氨基酸一个个依次连接上去。

以上介绍的仅是多肽合成要考虑的主要问题及其解决方法，实际上在合成中还有很多复杂的问题，特别是保持氨基酸原有构型的问题对所得多肽生理活性至关重要。而在构成肽链或脱去保护基的反应中，常常会发生外消旋化。此外由于合成步骤长，副产物多，在分离提纯方面也有不少的困难。

我国科学工作者经过艰苦努力，于1965年首次合成了具有全部生理活性的结晶牛胰岛素(其结构见图21-1)。这是我国科学史上的重大成就，它标志着我闰合成化学水平达到了一定的高度。

胰岛素是动物胰脏分泌出来的激素，它能降低血液葡萄糖的浓度。它是一种51肽，含有两个长肽链，A链(21个氨基酸单位）和B链(30个氨基酸单位）通过S—S键相连。4.多肽的固相合成

在一般多肽合成中，每生成一个肽键，都要经过氨基和羧基的保护，缩合脱水（包括羧基活化），去保护基等步骤。都必须纯化中间体，除去过量的试剂和副产物，操作非常繁杂费时。为简化操作，缩短合成时间，人们进行了多方面探索。1962年麦里费尔德（Merrifield)提出一种新的合成方法—多肽固相合成（solid-phasesynthesis)。[R.B.Merrifield，1921年出生于美国，在California大学获博士学位，任Rockefeller大学化学教授。由于他在多肽固相合成上的出色工作获1984年NobeL化学奖。]

固相合成的步骤是先将保护好NH2的氨基酸与树脂表面的官能团反应生成酯。这样就把该氨基酸固定在树脂上。去掉N保护剂后，再与另一个氨基酸（保护了NH2,活化了羧基）反应生成肽键。再去N保护剂，接下一个氨基酸，多次重复，直至预期数目的氨基