生物技术 第六章－分子标记优化学习资料

分子标记

MolecularMarkers2025/3/13园艺植物生物技术2Contents1、分子标记的原理

DNA是主要的遗传物质

DNA的生物学特性

DNA检测技术2、目前常用的分子标记技术

RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA，随机扩增的多态性DNA)SSR(simplesequencerepeat,微卫星标记)AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism，扩增片段长度多态性）3、分子标记在园艺植物中的应用2025/3/13园艺植物生物技术3标记（Markers）遗传标记（Geneticmarkers)：是能明确反映遗传多态性的生物特征。遗传多态性(Geneticpolymorphisms)：经典遗传学中指等位基因的变异；现代遗传学中指的是基因组中任何位点上的相对差异。Conceptions2025/3/13园艺植物生物技术41.形态标记2.细胞学标记3.生化标记4.分子标记TypesforGeneticmarkers2025/3/13园艺植物生物技术5概念：能明确反映遗传多态性的外观性状，一般用肉眼可识别，或物理仪器便可识别的性状。优点：直观、方便缺点：粗放，易变、数量有限Morphologicalmarker形态学上如何区分MorphologicalcharactersMorphologicalcharacters2025/3/13园艺植物生物技术8概念：能明确反映遗传多态性的细胞学特征，染色体结构的数目是常见的细胞学标记，它能反映染色体结构的数目的遗传多态性（染色体缺失、重复、倒位、易位）方法：染色体计数、染色体显带优点：较形态学标记稳定，可靠缺点：过程复杂、对材料和仪器要求严格Cytologicalmarker2025/3/13园艺植物生物技术9种类：可分为酶蛋白质和非酶蛋白质两类。在非酶蛋白质中用得最多的是种子贮藏蛋白同工酶（isoenzyes)：催化功能相同，但结构的生理性质不同的一类酶蛋白质标记的优点：数量更丰富，受环境影响更小。蛋白质标记的缺点：蛋白质受生物体发育的时空影响很大Biochemical(Protein)Marker2025/3/13园艺植物生物技术10DNAmarker概念：一切能揭示DNA多态性的技术手段；它是DNA水平上遗传多态性的直接反映，也就是通常人们所说的分子标记。分类： 1.基于DNA-DNA杂交的标记 2.基于PCR的DNA标记 3.PCR与杂交相结合的标记 4.SNP2025/3/13园艺植物生物技术11核酸水解单核苷酸磷酸基团核苷戊糖脱氧核酸（DNA）核酸（RNA）碱基TACGUDNARNAChemicalComponentofDNA&RNA2025/3/13园艺植物生物技术12TheStructureofDNA2025/3/13园艺植物生物技术13DoublehelixstructureofDNA5´3´5´3´5´3´5´3´磷酸核糖碱基T-A碱基对C-G碱基对2025/3/13园艺植物生物技术14BiologicalCharactersofDNA

2025/3/13园艺植物生物技术15MethodsforDNAExtraction方法：SDS法和CTAB法。原理：在去污剂和适当温度条件下使细胞充分裂解，并抑制DNA酶活性；经氯仿、苯酚等处理使蛋白质变性，离心后除去。溶液中的DNA经酒精或异丙醇沉淀。2025/3/13园艺植物生物技术16AgaroseGelElectrophoresis

DNA分子带负电，从琼脂糖凝胶的负极向正极泳动，速度依赖于其分子质量——小的紧密的DNA分子的较大伸展片断容易穿过琼脂糖介质。试剂：电泳缓冲液（TAE或TBE）；电泳琼指糖；EB或SYBRGreen；指示剂（加样缓冲液）仪器：电泳仪（直流电）；电泳槽

2025/3/13园艺植物生物技术17

FluorescenceStainingofDNAEB、SYBRGreen、DAPE等2025/3/13园艺植物生物技术18

FluorescenceStainingofDNA2025/3/13园艺植物生物技术19

IsotopeLabeling

2025/3/13园艺植物生物技术20ApparatusforDNAAssaying2025/3/13园艺植物生物技术21GelElectrophoresisPCR的发明，应用现状

及未来发展趋势2025/3/13园艺植物生物技术23PCR（聚合酶链式反应）全称：PolymerphaseChainReaction基本原理：是在试管中模拟细胞内的DNA复制2025/3/13园艺植物生物技术24DNA，

生命的蓝图故事发生在1983年

的春夏之交2025/3/13园艺植物生物技术26KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。

他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，

却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人员得

诺贝尔奖，Mullis是其中之一2025/3/13园艺植物生物技术27Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，……2025/3/13园艺植物生物技术28Mullis的第一个PCR实验1983年9月中旬。

Mullis在反应体系中加

入DNA聚合酶后在37

℃一直保温。结果第二

天在琼脂糖电泳上没有

看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。2025/3/13园艺植物生物技术29PCR的发展史1983年春，Mullis发展出PCR（polymerasechainreaction）的概念；1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202

），这回Mullis是第一发明人。1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，TaqDNApolymerase，这是85年春天Mullis建议做的；1988年，第一台PCR仪问世；1991年，HoffmanLaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。2025/3/13园艺植物生物技术302025/3/13园艺植物生物技术31PCR不只是一个方法改进Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。PCR的应用领域2025/3/13园艺植物生物技术33生物学领域几乎无处不用基因、DNA片段的克隆人工基因构建DNA序列测定基因定点突变基因型（突变）检测，SNP分析，遗传背景分析生物物种鉴定，系统进化研究基因表达量研究（real-timePCR）

/基因表达谱研究（DNAchip,SAGE）2025/3/13园艺植物生物技术34PCR仪器的变迁三个水浴锅，

用手移动

（Mullis等人当时用的）电加热块

＋

自来水冷却

（PE，1988）电加热块

＋

内置循环液冷却

（PE，1989）三个加热块

＋

机械手

（Stratagene，1994）半导体制冷和加热

（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）温度梯度,荧光检测

(如Roche的Lightcycler)Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈,厦门安普利等）2025/3/13园艺植物生物技术35PCR相关的术语和产品层出不穷T-vectorHotStartTaqRT-PCRRAPD-PCRDDRT-PCRLM-PCRInversePCRNestedPCRReal-timePCRRACEFlowchipPCRTASMultiplexPCRImmunoPCRAsymmetricPCRLP-PCRNASBARecombinantPCRAFLPSSCPInsituPCRTaqMan/SYBRgreen2025/3/13园艺植物生物技术36

PCR动画1stcycle2ndcycle3rdcycle过

程变

性引

物

退

火DNA复制2025/3/13园艺植物生物技术37

类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。PrincipleforPCR2025/3/13园艺植物生物技术3812345557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍

PrincipleforPCR2025/3/13园艺植物生物技术39

PCRReactionSystem10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul2025/3/13园艺植物生物技术40ImperativeelementsinPCRReaction引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）2025/3/13园艺植物生物技术41Primer引物是PCR特异性反应的关键。PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。2025/3/13园艺植物生物技术42TaqDNA聚合酶

TaqDNAPolymerphaseTaqDNA聚合酶是从Thermusaquaticus菌提取的热稳定性酶，分子量大约为94kDa。这种酶的天然形式可在74℃复制DNA，在95℃的半衰期为40分钟。TaqDNA聚合酶在镁存在的条件下可催化核苷酸沿5'-3'方向发生聚合反应，形成双链DNA；同时它还具有5'-3'外切酶活性。2025/3/13园艺植物生物技术43离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感。最适浓度为50mmol/L。忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。TaqDNAPolymerphase2025/3/13园艺植物生物技术44Template（targetgene）模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。对模板DNA质量的要求因标记的种类不同而有所差异，一般说来基于RFLP（酶切）的标记对DNA质量要求很高，而PCR标记对模板DNA质量要求并不很高，主要防止Taq酶抑制剂污染。2025/3/13园艺植物生物技术45

ConcentrationofMg2+Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。2025/3/13园艺植物生物技术46PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略PCR技术简介2025/3/13园艺植物生物技术47PCR标准反应体系DNA模板

引物

反应缓冲液dNTPddH2O

耐热聚合酶2025/3/13园艺植物生物技术48反应体系对PCR扩增的影响DNA模板纯度

蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性

模板降解会导致PCR扩增无产物浓度

加量过多导致非特异性扩增增加特异性

长度适当、避免二级结构和二聚体完整性

避免反复冻融浓度

应适当,过高导致非特异性增加,过低则引

物扩增产物太少2025/3/13园艺植物生物技术49反应体系对PCR扩增的影响反应Buffer

pH值,盐离子浓度稳定剂,增强剂Mg2＋浓度过高非特异性严重过低无扩增产物dNTPMixture浓度适当避免反复冻融ddH2OpH值适当避免污染2025/3/13园艺植物生物技术50PCR标准反应体系DNA模板

引物

反应缓冲液Mg2＋dNTPddH2O

耐热聚合酶2025/3/13园艺植物生物技术51如何选择最合适的DNA聚合酶

DNA聚合酶的特性

PCR

实验的不同需求2025/3/13园艺植物生物技术52如何选择最合适的DNA聚合酶

－－

DNA聚合酶的特性纯

度稳定性酶活性2025/3/13园艺植物生物技术53如何选择最合适的DNA聚合酶

－－

PCR

实验的不同需求长片段扩增PCR试剂盒

扩增效率

保

真

性

特

异

性

基因组扩增、RT-PCR

基因筛选、测序、

基因克隆

复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）构建基因图谱、测序、分子遗传学

复杂模板扩增、大规模基因检测2025/3/13园艺植物生物技术54特异性－

热启动Taq酶原

理

蜡封

抗体抑制

化学修饰特

点

避免非特异性扩增

提高PCR反应的特异性用

途

基因组扩增

RT-PCR2025/3/13园艺植物生物技术55－

热启动Taq酶特异性产

品

类

型产

品

名

称产

品

性

能化学修饰

天为时代:HotStartTaqRoche:FastStartTaqAbgene:Thermo-start®DNAPolymeraseStratagene:SureStart™Taq大大提高PCR反应的特异性

化学修饰不影响后续实验抗体抑制Invitrogen：AccuPrimeTMTaqPlatinum®

TaqTaKaRa：ExTaqTMHotStartVersion蜡封Promega：TaqBeadTM

HotStart2025/3/13园艺植物生物技术56保真性—高保真酶原

理用

途

3’－5’核酸

表达基因的克隆基因的定点突变

细胞内基因点突变分析（SNP）

外切酶活性

降低碱基错配率

2025/3/13园艺植物生物技术57

高保真

＋

高扩增效率原

理

混合酶－高扩增效率－3’－5’核酸外切用

途

超长片段扩增

－测序

－构建基因图谱

复杂模板扩增－GC含量高－二级结构2025/3/13园艺植物生物技术58PCR

MasterMix原

理预配好的PCR反应液DNA聚合酶

反应缓冲液dNTPPCR增强剂

2025/3/13园艺植物生物技术59PCR

MasterMix特

点

快速简便

减少加样误差和污染

灵敏度高

可扩增低至2个拷贝的目的模板

特异性强

降低PCR反应的要求，增强特异性

稳定性好

长期放置活性无改变适用范围

大规模基因检测

目的基因拷贝数极低的样本

GC含量高,有二级结构的模板

复杂基因组样本

可直接检测菌落，基因点突变检测,

或者阳性克隆的筛选。2025/3/13园艺植物生物技术60PCR常见问题

无扩增产物

非特异性扩增

拖尾

假阳性2025/3/13园艺植物生物技术61PCR常见问题之一无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

原因对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无；2025/3/13园艺植物生物技术62PCR常见问题之二

非特异性扩增

现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。2025/3/13园艺植物生物技术63PCR常见问题之二引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多

原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数

非特异性扩增2025/3/13园艺植物生物技术64PCR常见问题之三

拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

M122025/3/13园艺植物生物技术65PCR常见问题之三模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多

原因对策纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数

拖尾2025/3/13园艺植物生物技术66PCR常见问题之四

假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)

原因：靶序列或扩增产物的交叉污染

现象：空白对照出现目的扩增产物

对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

2025/3/13园艺植物生物技术67巢式PCR（Nest-PCR）四种策略

递减PCR（TouchDownPCR）

热启动PCR（HotStartPCR）

使用PCR增强剂2025/3/13园艺植物生物技术68策略之一巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4

巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。

巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。

2025/3/13园艺植物生物技术69策略之二递减PCR（TouchDownPCR）

递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm5℃。

特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。

递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。2025/3/13园艺植物生物技术70策略之三热启动PCR（HotStartPCR）

热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR

仪达到变性温度；

现在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；

热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。2025/3/13园艺植物生物技术71策略之四使用PCR增强剂

甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。

其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。

增强剂浓度要适当

从定性到定量的革命2025/3/13园艺植物生物技术73PCR产物生成曲线log[DNA]Cycles2025/3/13园艺植物生物技术74PCR琼脂糖凝胶电泳最终产物紫外光观察3-4小时2025/3/13园艺植物生物技术75PCR具有极高的灵敏度样品正对照负对照标准分子量

污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。用紫外灯破坏污染物也是一个办法2025/3/13园艺植物生物技术76log[DNA]Cycles不同样品有不同的生成曲线2025/3/13园艺植物生物技术77普通PCR和定量PCR的区别适用定性分析，不适合定量分析；PCR产物的长度从100bp－数kb实时检测:每个循环都产出荧光信号绝对定量，灵敏度更高

PCR产物的长度一般在60-150bps2025/3/13园艺植物生物技术78定量PCR相关的近年来

国际学术刊物上发表的论文数199619971998199920002003年已经达到3000篇2025/3/13园艺植物生物技术79Real-TimePCR，SYBRgreenCycle1Cycle3Cycle2MolecularProbe公司的一个专利产品，USPatent5,436,134

1993年7月12日申请2025/3/13园艺植物生物技术80SYBRgreen的优缺点简便可以使用已有的引物普遍通用可以检测所有的双链DNA，包括引物二聚体；需要化大力气优化反应条件，以消除非特异性扩增；价格

$1/PCR反应定量的灵敏度有所欠缺2025/3/13园艺植物生物技术81定量PCR，TaqMan体系ABI公司首先推出(PRISM7000系列)USPatent5,723,591,

1995年11月申请。实时检测:

每个循环都会产生与PCR产物成正比的荧光物质2025/3/13园艺植物生物技术82TaqMan系统的一个例子10ng0.001ngTitrateatemplate;10,1,0.1,0.01,0.001ng2025/3/13园艺植物生物技术83Taqman的优缺点

单一荧光系统中

不能在同一管中进行多片断扩增

不同的基因必须在不同的试管中管之间的精确度跟多荧光系统同等的精确和

可靠灵敏度高，定量方便费用高多种荧光提供仪器价格比较贵PCR会用于基因身份证的制作吗？2025/3/13园艺植物生物技术85

到2030年，预计只要1000美金就能得到个人的基因组序列。人与人之间平均1000个碱基对就有一个碱基呈多态性(SNP)。因此共有300万碱基上可能存在差异,而真正有价值的SNP也许只有1－2万个。

防治基因信息的滥用和基因歧视，将是今后社会的重任。2025/3/13园艺植物生物技术86现有数十种分子标记技术，万变不离其宗：

分子杂交、PCR扩增、序列分析。第一类：分子杂交为核心代表：RFLP、DNA指纹第二类：PCR为核心代表：RAPD、SSR、AFLP第三类：DNA序列为核心代表：ITS测序分析IntroductionofMolecularmarkers2025/3/13园艺植物生物技术87TypesofDNAMarkersRFLP-restrictionfragmentlengthpolymorphism(pm)（限制性片段长度多态性）VNTR-variablenumbertandemrepeat（变化数目的串联重复）RAPD-randomamplificationofpolymorphicDNA（随机扩增的多态性DNA）AFLP-amplifiedfragmentlengthpm（扩增片段长度多态性）SSR-simplesequencerepeat（简单序列重复）2025/3/13园艺植物生物技术88AdvantagesofDNAMarkers数量丰富、信息量大；与生长发育无关，取材不受限制；较多共显性，信息量完整在真核生物中，基因组DNA多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的DNA序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约2025/3/13园艺植物生物技术89ApplicationsofDNAMarkers种质资源研究品种纯度鉴定（包括DNA指纹鉴定）构建遗传连锁图基因定位（QTL）标记辅助选择比较基因组研究基因克隆（图位克隆）生物起源、进化、医学及法医学2025/3/13园艺植物生物技术90全称：

RestrictionFragmentLengthPolymorphism

(byBotstein,1980)基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱RFLP（限制性片段长度多态性）2025/3/13园艺植物生物技术91优点：共显性，非常稳定，是目前公认的最可靠的标记方法缺点：DNA纯度要求高、用量大；检测步骤多、周期长；费时、费钱；用作探针的DNA克隆制备、保存不方便；同位素有放射性自从人的RFLP图谱构建后，在番茄中构建了第一张植物的图谱，现在仍然广泛应用RFLP2025/3/13园艺植物生物技术92

PrincipleforRFLPsSameprincipleforDNA/DNA,DNA/RNA,orRNA/RNA2025/3/13园艺植物生物技术93PrincipleforRFLPs2025/3/13园艺植物生物技术94高质量DNA提取DNA酶切、电泳、转膜、固定探针制备、标记预杂交、杂交洗膜、压片、显影膜再生

ProceduresforRFLPs2025/3/13园艺植物生物技术95DNAMarkers

MostwidelyusedmarkersCanbehybridizationorPCR-basedTimerange-2hoursto1weekCandetectsinglenucleotidedifferenceSNP-singlenucleotidepolymorphorism2025/3/13园艺植物生物技术96HybridizationbasedMarker-RFLP性质：RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism)是DNA-DNA杂交的分子标记。原理:这种多态性是由于限制性酶切位点或位点附近的DNA区域发生变异所引起的。2025/3/13园艺植物生物技术97RFLP多态性的类型

TypeofPMinRFLPMarkers

2025/3/13园艺植物生物技术99ProcessesforRFLP

Manipulation1.高质量DNA的提取液氮研磨加入提取缓冲液温浴氯仿处理离心（上清液）酒精TE溶解质量检测（或纯化）提取DNA的两个条件：抑制DNA酶活性；加入去污剂破碎细胞。2025/3/13园艺植物生物技术1002.限制性酶切：

取10—15微克DNA，加入约5U于最适温度下保温12—18小时。ProcessesforRFLPManipulation2025/3/13园艺植物生物技术1013.转膜4.探针标记5.杂交6.洗膜7.放射自显影RFLP的操作

ProcessesforRFLPManipulation2025/3/13园艺植物生物技术102ExamplesofRFLPAnalysis

2025/3/13园艺植物生物技术103ByChengetal,2003.(PublishedinPMBR)

华中农业大学柑橘课题组ExamplesofRFLPAnalysisinCitrus2025/3/13园艺植物生物技术104

PCRBasedMarker—RAPDWilliams

等人于1990年首创的一种DNA技术，被称为RandomamplificationofPolymorphicDNA(随机扩增的多态性DNA）。2025/3/13园艺植物生物技术105原理：以PCR为基础,利用人工合成的约10b的随机序列寡核苷酸作引物,以生物的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,产生不连续的DNA产物,通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列的多态性。RAPD反应的循环次数可多达40—50次,每次循环中,双链DNA在95℃的高温下变性,解开双螺旋成为单链模板,然后在低温(36℃)条件下与随机引物结合,在DNA多聚酶的作用下，按碱基互补原则沿5‘至3’的方向把核苷酸链延长，完成DNA复制。如此反复数十次,可以使单一的DNA序列扩增105-107倍。PrincipleofRAPD2025/3/13园艺植物生物技术106PrincipleofRAPD2025/3/13园艺植物生物技术107PrincipleofRAPD2025/3/13园艺植物生物技术108RAPD的实验操作

ManipulationofRAPD一、

材料

不同来源的DNA(50ng/ul)。二、设备

PCR仪，PCR管或硅化的0.2mleppendorf管，电泳装置。三、试剂

1、随机引物(10mer)(5umol/L)。

2、Taq酶：购买成品。

3、10xPCR缓冲液。

4、MgCl2

：25mmol/L。

5、dNTP：每种2.5mmol/L2025/3/13园艺植物生物技术109四、反应体系：在25ul反应体系中加入：至25ul加ddH2O混匀稍离心,加一滴矿物油1单位（U）Taq酶2uldNTP2ulMgCl22.5ul10xPCRBuffer1ul(约5pmol)随机引物1ul(50ng)模板DNA体积（浓度）成分RAPD的实验操作

ManipulationofRAPD2025/3/13园艺植物生物技术110五、扩增程序在PCR仪中预变性94℃3分钟；然后循环:94℃1分钟，36℃1分钟，72℃1分钟，共40轮循环；循环结束后,72℃10分钟，4℃保存。六、电泳取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液于1.5%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100Ｖ，2—3小时。七、结果观察与记录一般RAPD带有5-15条,大小0.1-2.0kbRAPD的实验操作

ManipulationofRAPD2025/3/13园艺植物生物技术111RAPD标记的特征

CharacteristicsofRAPD

①引物很短（10base）②只有1种引物参与反应③引物在染色体上随机结合④退火温度低一般为35-37℃⑤当两引物在互补的模板DNA链上的结合位点距离小于2000bp便可扩增出该区域2025/3/13园艺植物生物技术112优点：--实验步骤少，省工、省力、进度快；--不需先知道基因组的任何分子信息；--所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本；--引物具有广泛性和通用性。缺点:

RAPD是一种显性标记,不能区分纯合子与杂合子；易受实验条件的影响,表现为扩增产物的稳定性差。RAPD标记的优、缺点

Advantages&DisadvantagesofRAPD2025/3/13园艺植物生物技术113SSR:SimpleSequenceRepeat，简单重复序列，又称微卫星DNA（microsatellite）或短的串联重复（ShortTandemRepeat,STR)。MicrosatelliteDNA：一类由几个核苷酸（一般1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的DNA序列。微卫星DNA广泛存在于真核生物中，人和动物（TG）n，植物（AT)n微卫星DNA长度的多态性;微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列。基于PCR的标记—SSR

PCRBasedMarker—SSR

2025/3/13园艺植物生物技术114微卫星的类型

TypesofMicrosatellites1、MononucleotideSSR(A)11 AAAAAAAAAAA2、 DinucleotideSSR(GT)6 GTGTGTGTGTGT3、 TrinucleotideSSR(CTG)4 CTGCTGCTGCTG4、 TetranucleotideSSR(ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC2025/3/13园艺植物生物技术115Homozygous…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG……CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG…

5’flankingregion microsatellitelocus 3’flankingregionHeterozygous…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG……CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG…微卫星的类型

TypesofMicrosatellites2025/3/13园艺植物生物技术116

根据两端序列的保守性设计引物进行PCR，电泳分离，染色显带以检测微卫星序列多态性。SSR标记的原理

PrincipleofSSR

多态性好、重复好、共显性标记2025/3/13园艺植物生物技术117SSR在染色体中的分布

WhereAreMicrosatellitesFound?Majorityarelocatedinnon-codingregion2025/3/13园艺植物生物技术118SSR标记的开发

StrategiesforSSRmarkerDevelopment1.基于DNA文库方法2025/3/13园艺植物生物技术119基于生物信息学方法110